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.2022年10月；29(10):1439-1451.
doi:10.1038/s41417-022-00453-6。 Epub 2022年4月6日。

EBV阳性NPC细胞HMGA2外体蛋白破坏血管内皮屏障并诱导内皮细胞向间充质细胞转化以促进转移

邓可丽 # 1, 陈兴瑞 # 1, 李娜·王 # 1 2, 王佳红 1, 李继科 1, 周子英 1, 辛莉（Xin Li） 三, 林伯才 4, 水生钟 4, 张晶晶 5, 曾玉梅 6, 张倩兵 1, 肖艳福 7, 刘晓明 8, 李敏英 9, 中西黄 10, 凯泰瑶 11
附属机构

EBV阳性NPC细胞HMGA2外体蛋白破坏血管内皮屏障并诱导内皮细胞向间充质细胞转化以促进转移

邓可丽等。 癌症基因治疗. 2022年10月.

摘要

血管通透性增加有助于转移。癌分泌的外泌体是新出现的抗癌串扰介质。EB病毒（EBV）被确认为第一种人类肿瘤相关病毒，在转移性肿瘤，尤其是鼻咽癌（NPC）中起着至关重要的作用。迄今为止，EBV感染的鼻咽癌细胞的外泌体是否以及如何影响血管通透性尚不清楚。在这里，我们发现EBV阳性NPC细胞的外泌体，而不是EBV阴性NPC细胞外泌物，破坏了内皮细胞紧密连接（TJ）蛋白，这是防止转移的天然屏障，并促进内皮细胞中的内皮-间充质转化（EndMT）。蛋白质组学分析表明，EBV阳性NPC细胞外泌体中HMGA2蛋白的水平高于EBV阴性NPC细胞的外泌体内HMGA2的水平。EBV阳性NPC细胞外泌体中HMGA2的耗尽可减轻内皮细胞功能障碍和肿瘤细胞转移。相反，HMGA2过度表达EBV阴性NPC细胞的外显子促进了这些过程。此外，我们发现HMGA2上调了蜗牛的表达，这有助于减少内皮细胞中的TJ蛋白和EndMT。此外，有转移的鼻咽癌患者循环外泌体中HMGA2的水平显著高于无转移和健康阴性对照者，并且肿瘤细胞中HMGA1的水平与内皮细胞中TJ和EndMT蛋白的表达有关。总之，我们的研究结果表明，EBV阳性NPC细胞的外体HMGA2通过靶向多个内皮细胞TJ和促进EndMT来促进肿瘤转移，这突出表明分泌的HMGA2是潜在的治疗靶点和NPC转移的预测标记物。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。来自EBV阳性NPC细胞的外显子减少内皮细胞TJ蛋白表达并促进EndMT。
A类用PKH-67（绿色）标记的纯化NPC细胞衍生外体或PKH-67洗涤缓冲液（比例尺）处理的HUVEC的共焦显微镜分析 = 20 微米）。B类0.4生长的经处理HUVEC单层的渗透率 μm过滤器是通过罗丹明右旋糖酐的出现来测量的，在实验开始时，罗丹明右旋糖酐被添加到顶部井中，在2 h时间进程。590时的吸光度 指示每个时间点的nm***第页<0.001.CHUVEC单层生长在3 在将GFP标记的5-8F细胞接种到Transwell插入物中之前，按照指示处理μm过滤器。10之后 h、 滤镜底部的GFP+细胞在荧光显微镜下定量***第页<0.001.D类用PBS、HK1-Exo、CNE2-Exo、NPC43-Exo、C666-1-Exo和C17-Exo处理细胞后，内皮细胞形态变化的典型图像（左面板）和量化直方图（右面板）***第页<0.001.电子通过Western blotting分析PBS、HK1-Exo、CNE2-Exo、NPC43-Exo、C666-1-Exo和C17-Exo处理的HUVEC的TJ蛋白（ZO-1、VE-cadherin、clodin和claudin-5）、CD31、α-SMA、Vimentin和S100A4。F类HUVEC单层按指示处理48 h，用免疫荧光法分析ZO-1（绿色）、VE-cadherin（绿色）和clodin（绿色）以及claudin-5（绿色），CD31（红色）、α-SMA（绿色）及Vimentin（红色）和S100A4（绿色）。DAPI（蓝色）：细胞核。
图2
图2。来源于EBV阳性NPC细胞的外泌体在体内诱导血管通透性并促进转移。
A类收集的肺组织和肝组织进行VE-粘附素（绿色）和CD31（红色）的双标记免疫荧光。CD31的正结构用箭头表示。比例尺代表100 微米。B类体内血管通透性由组织中静脉注射罗丹明提取物的外观决定（红色）(n个 = 6). 显示了具有代表性的图像。DAPI（蓝色）：细胞核。比例尺代表100 微米。C肝和肺的大体外观在尾静脉注射转移模型和转移灶定量分析中。数据表示为平均值 ± 标准偏差(n个 = 6只生物独立的动物）***第页<0.001.D类代表性苏木精和伊红（H&E）染色的肝和肺转移性肿瘤结节，以及转移性结节的定量分析。数据表示为平均值 ± 标准偏差(n个 = 6只生物独立的动物）***第页<0.001.
图3
图3。HMGA2在EBV阳性NPC细胞的外泌体中富集，并在体外增加内皮细胞的血管通透性和EndMT。
A类Western blotting检测EBV阴性NPC细胞株（HK1、HONE1、SUNE1、HNE1、CNE2、TW03和5-8F细胞）和EBV阳性NPC细胞系（NPC43、C666-1和C17细胞）外显子中HMGA2蛋白水平。Western blotting至少进行了三次。B类分别在HK1细胞和NPC43细胞中过度表达和敲除HMGA2后，分析相应细胞源性外泌体中HMGA2的含量。HMGA2在HUVEC中的表达变化，如治疗12 用Western blotting分析h(C)HMGA2（绿色）免疫荧光，细胞核DAPI（蓝色）染色(D类). Western blotting进行了三次。电子根据48例患者的指示处理细胞后，内皮细胞形态改变的典型图像（高面板）和量化直方图（低面板） 小时***第页<0.001.F类HUVECs按指示处理48 通过Western blotting分析TJ蛋白、CD31、α-SMA、波形蛋白和S100A4。Western blotting进行了三次。G公司0.4生长的经处理HUVEC单层的渗透率 μm滤光片通过罗丹明提取物的外观进行测量***第页<0.001.H（H）HUVEC单层生长在3 在将GFP标记的5-8F细胞接种到Transwell插入物中之前，按照指示处理μm过滤器。10之后 h、 滤镜底部的GFP+细胞在荧光显微镜下定量***第页<0.001.
图4
图4。外体HMGA2通过蜗牛降低内皮细胞TJ蛋白表达并促进EndMT。
A类顶部，HUVEC中受NPC43细胞源性外泌体影响的途径，与HK1细胞源性外泌体和PBS相比。底部，选定途径中差异表达基因的热图。B类与对照组相比，HMGA2过度表达的HUVEC中受HMGA2影响的途径。底部是参与选定路径的差异表达基因的热图。C用来源于EBV阴性NPC细胞（HK1、HONE1、SUNE1、HNE1、CNE2、TW03和5-8F细胞）和EBV阳性NPC细胞（NPC43、C666-1和C17细胞）的外泌体处理后HUVEC中Snail水平的蛋白质印迹分析。Western blot检测三次。D类根据48例患者的指示处理细胞后，内皮细胞形态改变的典型图像（高面板）和量化直方图（低面板） 小时***第页<0.001.电子HUVEC感染shSnail 48 h，然后用NPC43-Exo处理48 h.通过Western blotting分析细胞裂解液中的TJ蛋白、CD31、α-SMA、波形蛋白和S100A4。Western blotting进行了三次。F类通过罗丹明-提取物的吸收值测量按指示处理的HUVEC单层的渗透性***第页<0.001.G公司HUVEC单层生长在3 在将GFP标记的5-8F细胞接种到Transwell插入物中之前，按照指示处理μm过滤器。10之后 h、 滤纸底部的GFP+细胞在荧光显微镜下定量***第页<0.001.
图5
图5。来自EBV阳性NPC细胞的外体HMGA2可诱导血管通透性并促进体内转移。
A类BALB/C裸鼠每隔两天用来自指示细胞的外泌体预处理四次，然后收集的肺和肝组织进行VE-cadherin（绿色）和CD31（红色）的双标记免疫荧光。CD31的正结构用箭头表示。比例尺代表100 微米。B类经HMGA2过度表达的外泌体治疗后，血管系统表现出较高的通透性。用HMGA2高或低表达的外泌体预处理的小鼠静脉注射罗丹明提取物，并使用冷冻肿瘤组织切片进行荧光显微镜成像。罗丹明提取物呈红色荧光，DAPI染色细胞核呈蓝色。比例尺，50 微米。C肝和肺的大体外观在尾静脉注射转移模型和转移灶定量分析中。数据表示为平均值 ± 标准偏差(n个 = 6只生物独立的动物）***第页<0.001.D类肝和肺中典型的H&E染色转移性肿瘤结节以及转移性结节的定量分析。数据以平均值表示 ± 标准偏差(n个 = 6只生物独立的动物）***第页<0.001.电子HMGA2在小鼠血清源性外泌体中的表达，该外泌体内的肿瘤来源于5-8F细胞，HMGA2过表达与否。F类将来源于5-8F细胞的皮下异种移植瘤瘤块（HMGA2过度表达和不过度表达）移植到BALB/C裸鼠的肝脏中。采集的肺部进行ZO-1（绿色）和CD31（红色）双标记免疫荧光。CD31的正结构用箭头表示。比例尺代表100 微米。G公司用罗丹明提取物测定肺组织中5-8F HMGA2 OE对照组或5-8F-HMGA2 OE肿瘤BALB/C裸鼠的肺血管通透性。罗丹明提取物呈红色荧光，DAPI染色细胞核呈蓝色。比例尺，50 微米。H（H）将5-8F/vec或5-8F/HMGA2肿瘤注入肝脏，显示不同组的肝脏大体外观和肝脏重量定量分析。我肝转移模型中肺的大体外观和转移灶的定量分析。数据表示为平均值 ± 标准偏差(n个 = 6只生物独立的动物）***第页<0.001.J型代表性H&E染色定量分析肺转移瘤结节和转移结节的数量。数据表示为平均值 ± 标准偏差(n个 = 6只生物独立的动物）***第页<0.001.
图6
图6。HMGA2与鼻咽癌的转移进展、TJ蛋白表达和EndMT有关。
A类通过透射电镜和Western blotting鉴定健康阴性对照血清外泌体和鼻咽癌血清外泌物体的特征。B类健康阴性对照血清外泌体和有无转移的鼻咽癌血清外泌物中HMGA2的含量。用ImageJ进行密度测定***第页<0.001.C通过罗丹明-外显子的吸收值测定健康阴性对照组和有无转移的鼻咽癌患者的循环外显子处理的HUVEC单层的通透性***第页<0.001.D类用健康阴性对照组的血清外泌体和有或无转移的鼻咽癌患者48例的血清外逸体处理细胞后，内皮细胞形态改变的典型图像（左面板）和量化直方图（右面板） 小时***第页<0.001.
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