跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

政府意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2022年1月1日1:27:699-717。
doi:10.1016/j.omn.2021.12.035。 eCollection 2022年3月8日。

SPI1诱导的FTO下调通过以m6A依赖的方式调节pri-miR-10a处理促进GBM进展

张寿吉 1 2, 赵树林 1 2, 燕化旗 1 2, 李伯彦 1 2, 王慧智 1 2, 潘子文 1 2, 郝雪 1 2, 川地金 三 4, 魏秋 1 2, 陈子航 1 2, 郭勤东 1 2, 杨帆 1 2, 徐建业 1 2, 高紫洁 1 2, 王绍波 1 2, 兴国 1 2, 林登 1 2, 倪石磊 1 2, 傅忠学 三 4, 王健（Jian Wang） 1 2 5, 赵荣荣 1 2, 李刚（音译） 1 2
附属公司

SPI1诱导的FTO下调通过以m6A依赖的方式调节pri-miR-10a处理促进GBM进展

张寿吉等人。 摩尔核酸. .

摘要

作为mRNA和非编码RNA最常见的转录后修饰之一，N6-甲基腺苷（m6A） 修饰几乎调节RNA代谢的各个方面。证据表明m的失调6一种修饰蛋白和相关蛋白有助于胶质母细胞瘤（GBM）的进展。然而，脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）的功能6一种去甲基化酶尚未在GBM中进行系统和全面的研究。在这里，我们发现临床标本中FTO表达降低与胶质瘤分级较高和临床预后较差相关。功能上，FTO抑制GBM细胞的生长和侵袭在体外和体内FTO在机械上调节了m6主要microRNA-10a（pri-miR-10a）的修饰，可被读者HNRNPA2B1识别，招募microRNA微处理器复合蛋白DGCR8并介导pri-miR-10a加工。此外，FTO的转录活性受到转录因子SPI1的抑制，SPI1抑制剂DB2313可以特异性地干扰该转录因子。用该抑制剂治疗可恢复内源性FTO表达并降低GBM肿瘤负担，提示FTO可作为GBM的一种新的预后指标和治疗分子靶点。

关键词：DB2313；自由贸易区；N6-甲基腺苷；SPI1；胶质母细胞瘤；pri-miR-10a。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

无
图形摘要
图1
图1
FTO表达下调与GBM患者预后不良相关（A）胶质瘤患者组织和正常脑组织（NT）中FTO的表达水平，以及（B）TCGA、CGGA、REMBRANDT、Gravendel和Philips数据集中FTO高表达和低表达患者的Kaplan-Meier生存曲线；采用log-rank检验确定差异的显著性。（C） GSEA检测FTO-高表达和FTO-低表达GBM样品中的间充质特征。NES，归一化富集分数；FDR，错误发现率。（D） 200倍和400倍放大镜下不同WHO分级的正常组织（NT）和胶质瘤组织中FTO蛋白表达的IHC分析。比例尺，50μm。（E） 表示IHC统计数据的直方图。FTO阳性率定义为同一区域内FTO阳性细胞核数与总细胞核数之比（n=3）。（F） Western blot显示FTO蛋白在胶质瘤组织样本中的表达。GAPDH用作标准化对照。（G） 神经原（PN）和间充质（MES）亚型胶质瘤干细胞（GSC）中FTO的蛋白表达水平。（H） 正常人星形胶质细胞（NHAs）和胶质瘤细胞系U87MG、U251、A172、LN229、U118MG和P3中FTO的蛋白表达水平。分别使用双尾t检验和单向方差分析对两个独立样本和多个样本进行比较。误差线表示至少三个独立实验，数据显示为平均值±标准偏差。*p<0.05，*p<0.01，*p<0.001，和*p<0.0001。
图2
图2
FTO过度表达抑制GBM细胞的生长、迁移和侵袭在体外和体内（A） 用控制慢病毒（ovNC）和FTO-过表达慢病毒（ov FTO）转导后，U87MG、A172和U118MG细胞中FTO的表达水平。以GAPDH为对照。（B） 采用CCK-8法评估慢病毒转导的U87MG和A172细胞的增殖能力。（C） 对U87MG和A172细胞进行Transwell分析。显示了具有代表性的图像。比例尺，50μm。代表迁移或入侵细胞数量的直方图。数据表示为平均值±SD；n=3。（D） 慢病毒转导的U87MG细胞三维肿瘤球体侵袭试验。显示0、24、48和72小时的图像；比例尺，200μm。（E） 用ovNC或ovFTO慢病毒转导的U87MG、A172和U118MG细胞中ZEB1、CD44、N-钙粘蛋白、PCNA、mmp2和波形蛋白的蛋白水平。以GAPDH为对照。（F） 用慢病毒转导并通过球体直径量化的GSC267细胞的肿瘤球体形成的代表性图像。比例尺，100μm。（G） 慢病毒转导GSC267细胞的极限稀释试验。数据表示三个独立实验的平均值±SD。（H） 用慢病毒转导的GSC267细胞中FTO、CD44和YKL40的蛋白水平。β-肌动蛋白作为标准化对照。（一）体内植入后第12天异种裸鼠肿瘤生长的生物发光成像分析。（J） 牺牲当天FTO过度表达或阴性对照U87MG细胞组织异种移植切片的H&E染色；刻度条，1000μm（左）和100μm（右）。（K） 超表达控制序列或FTO的慢病毒转导的U87MG细胞原位移植裸鼠存活分析（n=5/组）；采用log-rank检验确定差异的生存意义。分别使用双尾t检验和单向方差分析对两个独立样本和多个样本进行比较。误差线表示至少三个独立实验，数据显示为平均值±标准偏差。*p<0.05，*p<0.01，*p<0.001，和*p<0.0001。
图3
图3
敲除FTO促进GBM细胞的生长、迁移和侵袭在体外和体内（A） 携带两个短发夹RNA序列（shFTO-1和shFTO-2）的对照慢病毒（shNC）或FTO-击倒慢病毒转导的U251、LN229和P3细胞中FTO的表达水平。以GAPDH为对照。（B） 使用CCK-8测定法评估用慢病毒转导的LN229和U251细胞的增殖能力。（C） LN229和U251细胞的Transwell分析。显示了具有代表性的图像。比例尺，50μm。直方图表示迁移或入侵细胞的数量。（D） 慢病毒转导LN229细胞的三维肿瘤球体侵袭试验。显示0、24、48和72小时的图像；比例尺，200μm。（E） 用shNC、shFTO-1或shFTO-2慢病毒转导的P3、LN229和U251细胞中ZEB1、CD44、N-钙粘蛋白、mmp2、PCNA和波形蛋白的蛋白水平。以GAPDH为对照。（F） 用shNC、shFTO-1或shFTO-2慢病毒转导的GSCs 8–11的神经球形成分析。（G） 用shNC、shFTO-1或shFTO-2慢病毒转导的GSCs 8–11的极限稀释分析。（H） 用shNC或shFTO慢病毒转导的GSCs 8–11中FTO和YKL40的蛋白水平。β-肌动蛋白作为正常对照。（一）体内第6天异种裸鼠肿瘤生长的生物发光成像分析。（J） 处死当天FTO敲除或阴性对照LN229细胞组织异种移植切片的H&E染色；比例尺，1000μm（左）和100μm（右）。（K） shNC或shFTO慢病毒转导的LN229细胞原位移植裸鼠存活分析（n=5/组）；采用log-rank检验确定差异的生存意义。分别使用双尾t检验和单向方差分析对两个独立样本和多个样本进行比较。误差线表示至少三个独立实验，数据显示为平均值±标准偏差。*p<0.05，*p<0.01，*p<0.001，和*p<0.0001。
图4
图4
FTO调节miR-10a的成熟6依赖A的方式（A）定量分析6用ovNC、ovFTO、shNC、shFTO-1和shFTO-2慢病毒转导的U87MG、A172、LN229和U251细胞中的A水平。（B） 火山图显示了GBM组织与正常脑组织（NT）中上调和下调miRNA的miRNA测序结果。（C） 维恩图显示了显著上调的miRNAs（log FC>4，p形容词<0.05）和同时受METTL3和HNRNPA2B1影响的miRNAs。用ovNC和ovFTO慢病毒转导后的（D）U87MG和A172细胞中成熟miR-10a-5p和pri-miR-10a的表达水平，或用shNC、shFTO-1和shFTO-2慢病毒转染后的（E）LN229和U251细胞中成熟的miR-10a和pri-mi R-10a表达水平。（F） 检测pri-miR-10a m6MeRIP-qPCR分析检测到的控制或FTO过度表达U87MG细胞和shNC、shFTO-1或shFTO-2 LN229细胞中的修饰水平。（G） 用小干扰RNA控制（siNC）或小干扰RNA HNRNPA2B1 1（siHNRNPA1-1）和2（siHRNNPA2B1-2）转染U87MG和LN229细胞后，成熟miR-10a-5p和pri-miR-10a表达水平。（H） DGCR8和HNRNPA2B1之间的相互作用。用ovNC或ovFTO慢病毒转导U87MG细胞，并与抗DGCR8抗体共同免疫沉淀。HNRNPA2B1、FTO和DGCR8的蛋白质印迹如图所示。定量直方图表示相对HNRNPA2B1富集水平。（一） 抗DGCR8抗体在转导shNC、shFTO-1和shFTO-2慢病毒的LN229细胞中的共免疫沉淀。量化直方图表示HNRNPA2B1的相对富集水平。（J） 用抗HNRNPA2B1抗体免疫沉淀法检测U87MG细胞中与HNRNPA2 B1结合的pri-miR-10a的丰度，然后进行RIP-qPCR分析。（K） 双荧光素酶质粒设计示意图。（五十） U87MG细胞的双重荧光素酶分析。如图所示，用野生型（WT）或突变型（Mut）报告载体和siNC或siHNRNPA2B1共同转染细胞。（M） pri-miR-10a突变设计示意图。分别使用双尾t检验和单向方差分析对两个独立样本和多个样本进行比较。误差线表示至少三个独立实验，数据显示为平均值±标准偏差。*p<0.05，*p<0.01，*p<0.001，和*p<0.0001。
图5
图5
通过miR-10a（A）分析五个数据集中FTO表达与miR-10a靶点MTMR3之间的相关性，可以逆转FTO对GBM进展的抑制作用。采用皮尔逊相关系数分析进行统计分析。（B） 用FTO过度表达、敲除和相应的对照慢病毒转导的GBM细胞中MTMR3 mRNA的表达。（C） 与ovNC或ovFTO慢病毒联合转导的U87MG细胞中MTMR3、CD44、PCNA、FTO和GAPDH的蛋白表达，并模拟NC或miR-10a-5p模拟物，如图所示。量化直方图表示相对蛋白质表达。（D） 将LN229细胞与shNC、shFTO-1或shFTO-2慢病毒和抑制剂NC或miR-10a-5p抑制剂共转导。量化直方图表示相对蛋白质表达。与ovNC或ovFTO慢病毒联合转导的U87MG细胞中（E）miR-10a-5p和（F）MTMR3的RNA表达，并模拟NC或miR-10a-5p模拟物，如图所示。如图所示，LN229细胞与shNC、shFTO-1或shFTO-2慢病毒和抑制剂NC或miR-10a-5p抑制剂共同转导。（G） 转染（左）型抑制因子NC或（右）型miR-10a-5p抑制因子的LN229细胞在存在或不存在FTO敲除的情况下，转染（左图）型U87MG细胞的CCK-8分析模拟NC或miR-10a-5p模拟FTO过度表达。（H） 如图所示，在存在或不存在FTO过表达的情况下，用模拟物NC或miR-10a-5p模拟物转染的U87MG细胞的Transwell测定。比例尺，50μm。（一） 转染抑制剂NC或miR-10a-5p抑制剂的LN229细胞在存在或不存在FTO敲除的情况下的Transwell分析。比例尺，50μm。（J） 裸鼠异种移植切片中U87MG细胞中MTMR3表达的IHC。比例尺，50μm。分别使用双尾t检验和单向方差分析对两个独立样本和多个样本进行比较。误差线表示至少三个独立实验，数据显示为平均值±标准偏差。*p<0.05，*p<0.01，*p<0.001，和*p<0.0001。
图6
图6
SPI1抑制FTO（A）启动子区预测的SPI1 DNA结合序列的转录活性。（B） TCGA和CGGA数据库中FTO和SPI1之间的相关性以及SPI1和MTMR3之间的相关性。采用皮尔逊相关系数分析进行统计分析。（C） 转染siNC、siSPI1或siSPI1-2的GBM细胞中SPI1（左）和FTO（右）的相对mRNA表达。（D） 转染siNC、siSPI1或siSPI1-2的GBM细胞中SPI1、FTO、MTMR3、N-cad、CD44、PCNA和波形蛋白的蛋白表达。（E） GBM细胞中FTO启动子区的ChIP-PCR。（F） 用siNC、siSPI1-1或siSPI1-2转染的GBM细胞中的相对FTO启动子萤光素酶活性。（G） 在有或无SPI1结合基序突变的GBM细胞中，FTO启动子荧光素酶的相对活性。（H） 如图所示，在存在或不存在FTO的情况下，对转染siNC或siSPI1的U87MG和U118MG GBM细胞进行Transwell分析。比例尺，50μm。（一） 如图所示，在存在或不存在FTO的情况下，对转染siNC或siSPI1的U87MG和U118MG GBM细胞进行CCK-8分析。分别使用双尾t检验和单向方差分析对两个独立样本和多个样本进行比较。误差线表示至少三个独立实验，数据显示为平均值±标准偏差。*p<0.05，*p<0.01，*p<0.001，和*p<0.0001。
图7
图7
SPI1抑制剂DB2313阻断了FTO（A）的转录抑制。SPI1和DB2313的二维（2D）结合模式。（B） DB2313在SPI1分子表面的结合模型。DB2313呈青色，SPI1的分子表面呈淡黄色（顶部）；SPI1和DB2313的3D绑定模式。DB2313为青色，装订袋中周围的残留物为黄色，受体的主干被描绘为透明的白色卡通（下图）。（C） DMSO或DB2313处理的GBM细胞中FTO、MTMR3、CD44、PCNA和GAPDH的蛋白表达。（D） CCK-8检测用DMSO或DB2313（10μg/mL）处理的GBM细胞。（E） 如图所示，使用DMSO或DB2313处理的GBM细胞的Transwell分析。比例尺，50μm。（F） 皮下植入U87MG细胞后，将DB2313（10 mg/kg/天）或载体腹腔注射到小鼠体内（每组5只）。（G） 从处死的小鼠身上测量肿瘤的体积和重量，并显示为方框和胡须图。（H） 用DB2313或匹配组处理的U87MG GBM细胞皮下异种移植小鼠的异种移植切片中FTO、Ki67和CD44的免疫荧光染色代表图像。比例尺，50μm。（I） 提出了FTO介导的pri-miR-10a处理在GBM肿瘤中作用的模型。分别使用双尾t检验和单向方差分析对两个独立样本和多个样本进行比较。误差线表示至少三个独立实验，数据显示为平均值±标准偏差。*p<0.05，*p<0.01，*p<0.001，和*p<0.0001。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Jackson C.M.，Choi J.，Lim M.免疫治疗抵抗机制：胶质母细胞瘤的教训。自然免疫学。2019;20:1100–1109。-公共医学
    1. Bi J.、Chowdhry S.、Wu S.、Zhang W.、Masui K.、Mischel P.S.改变了胶质瘤中的细胞代谢，这是一个可操作的共同依赖靶点的新兴景观。Nat.Rev.癌症。2020;20:57–70.-公共医学
    1. Wang Q.，Hu B.，Hu X.，Kim H.，Squatrito M.，Scarpace L.，deCarvalho A.，Lyu S.，Li P.，Li.Y.等。胶质瘤-固有基因表达亚型的肿瘤进化与微环境中的免疫学变化相关。癌细胞。2017;32:42–56.e6。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Tan A.、Ashley D.、López G.、Malinzak M.、Friedman H.、Khasraw M.胶质母细胞瘤的治疗：现状和未来方向。加州癌症杂志临床。2020;70:299–312.-公共医学
    1. Haussmann I.、Bodi Z.、Sanchez-Moran E.、Mongan N.、Archer N.、Fray R.、Soller M.mA增强Sxl替代性前mRNA剪接，用于果蝇性别决定。自然。2016;540:301–304.-公共医学