Genome-wide maps of nucleolus interactions reveal distinct layers of repressive chromatin domains

doi:10.1038/s41467-022-29146-2

.2022年3月18日；13(1):1483.

doi:10.1038/s41467-022-29146-2。

核仁相互作用的基因组图揭示了抑制染色质结构域的不同层

克里斯蒂亚娜·贝萨利里^1 2, 杰琳娜·克雷索亚·拉基奇¹, 什瓦尼·古普塔¹, 多米尼克·巴赫¹, 罗斯斯拉夫·库兹亚基夫^1 三, 玛蒂娜·帕纳塔^1 4, 拉斐拉·桑托罗⁵

附属公司

¹瑞士苏黎世8057苏黎世大学DMMD疾病分子机制系。
²苏黎世大学苏黎世生命科学研究生院分子生命科学项目，瑞士苏黎世8057。
^三瑞士苏黎世8057苏黎世大学科学信息技术服务与支持。
⁴苏黎世大学苏黎世生命科学研究生院RNA生物学项目，瑞士苏黎世8057。
⁵瑞士苏黎世8057苏黎世大学DMMD疾病分子机制系。raffaella.santoro@dmmd.uzh.ch。

PMID： 35304483
预防性维修识别码：项目管理委员会8933459
内政部： 10.1038/s41467-022-29146-2

核仁相互作用的基因组图揭示了抑制染色质结构域的不同层

克里斯蒂亚娜·贝萨利里等。国家公社. 2022.

.2022年3月18日；13（1）:1483。

doi:10.1038/s41467-022-29146-2。

作者

附属公司

¹瑞士苏黎世8057苏黎世大学DMMD疾病分子机制系。
²苏黎世大学苏黎世生命科学研究生院分子生命科学项目，瑞士苏黎世8057。
^三瑞士苏黎世8057苏黎世大学科学信息技术服务与支持。
⁴苏黎世大学苏黎世生命科学研究生院RNA生物学项目，瑞士苏黎世8057。
⁵瑞士苏黎世8057苏黎世大学DMMD疾病分子机制系。raffaella.santoro@dmmd.uzh.ch。

PMID： 35304483
预防性维修识别码：项目管理委员会8933459
内政部： 10.1038/s41467-022-29146-2

摘要

真核染色体折叠成等级结构域，形成功能分区。核外周和核仁是导致抑制性染色体结构的两个核标志。然而，虽然核膜（NL）在基因组组织中的作用已经有了很好的记录，但由于缺乏核仁相关结构域（NADs）的鉴定方法，核仁的功能仍有待研究。在此，我们建立了基于DamID和HiC的方法，以生成胚胎干细胞（ESCs）和神经前体细胞（NPC）中NAD的准确全基因组地图，揭示了基于与核仁、NL或两者的相互作用而具有不同抑制染色质状态的基因组划分层。与仅与NL相互作用的区域相比，NAD显示出更高的H3K9me2和更低的H3K27me3含量。当ESC分化为NPC时，核仁周围的染色体获得了更紧凑、更坚硬的结构，神经基因离开核仁，并为随后的激活而解锁。此外，组蛋白修饰和ESCs中NADs和LADs的A和B分区内的相互作用强度决定了在分化过程中从各自的分区分离时与NL或核仁相关的选择。这里开发的方法将有可能包括核仁在核空间中的贡献和基因组在不同生物系统中的功能。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

**图1。Nucleolar-DamID的建立。**
一代表建立Nucleolar-DamID战略的方案。b条用表达H2B-GFP和H2B-GFP-NoLS的质粒在最小CMV启动子下转染NIH3T3细胞24小时后的活细胞成像。相位对比图像有助于核仁的可视化。**c（c）**转染表达H2B-GFP和H2B-NoLS-GFP质粒的NIH3T3细胞的代表性免疫荧光图像。核仁蛋白NPM1可以显示核仁。比例尺代表5μm。天使用抗GFP抗体，通过western blot分析转染H2B-GFP和H2B-GFP-NoLS的NIH3T3细胞等效数量的染色质结合（Chrom.）和可溶性（Sol.）部分。Coxa4和组蛋白显示为负载和分馏控制。**e（电子）**用表达H2B-GFP、TTF1-GFP和H2B-NoLS-GFP的质粒转染NIH3T3细胞的代表性免疫荧光图像，并用或不用ActD（50 ng/ml）处理24小时。转染24小时后将ActD添加到细胞中。核仁蛋白纤维蛋白用于观察未经处理的细胞中的核仁和经ActD处理的细胞的核仁帽。低DAPI强度可显示大核仁。比例尺代表5μm。**（f）**代表用于双诱导表达Dam-fuse H2B和核仁H2B（H2B-NoLS）蛋白的构建物的方案。克qRT-PCR显示在ESCs中H2B-Dam和H2B-NoLS-Dam的表达水平相似。三个生物学独立实验数据的平均值。误差线代表s.d。小时rRNA基因和*Tuba1a公司*在ESCs中，分别用100 ng多西环素（Dox）和1μM Shield1处理和不处理15 h。m6A水平通过用被m6A阻断的DpnII消化基因组DNA来测量，然后用包含Dam GATC元件的引物进行定量扩增。通过使用包含缺少GATC序列的引物进行测量，实现了标准化。四个生物学独立实验数据的平均值。误差条代表标准差。统计显著性(对-值）使用成对双尾t吨测试（***<0.001）。源数据作为源数据文件提供。

**图2。Nucleolar-DamID识别NAD。**
一NAD、LAD、A和B区以及ESCs中早期和晚期复制DNA的染色体视图。NAD以对数表示₂H2B-Dam-NoLS和H2B-Dam之间m6A水平的比率。iNAD：不与核仁接触的结构域。iLAD:未联系NL的域。b条条形图表示小鼠染色体上的NAD覆盖值。红线显示每个染色体着丝粒近端的NAD覆盖值。虚线表示NAD全基因组覆盖率。**c（c）**核仁H2B-Dam染色体相互作用图。天从HiC地图获得rDNA-contacts。数据表示每个染色体唯一接触者的HiC得分。统计显著性(对-值）使用未配对的双尾t吨测试（****<0.0001）。线是平均值。**e（电子）**代表性图像显示从第9和18号染色体上的HiC-rDNA获得的rDNA接触者的标准化计数分数。**（f）**rDNA触点的分布。值表示每个染色体五分位的唯一接触数的比例。统计显著性(对-值）使用未配对的双尾t吨测试（***<0.0001）。克Nucleolar-DamID识别的NAD在rDNA接触中富集。数据表示NAD和非接触核仁区域（iNAD）独特HiC-rDNA接触的比例。小时在NAD和iNAD中确定的唯一rDNA接触者的Hi-C标准化计数分数。统计显著性(对-值）使用未配对的双尾t吨测试（****<0.0001）。方框图描述了最小值和最大值。方框内的水平线表示平均值。我,j个上部面板表示1号染色体的NAD和LAD剖面(我)和5(j个)以及DNA-FISH探针（橙色条）与Nucleolar-DamID识别为仅NAD的区域杂交。下部面板。核仁蛋白（红色）与相应的DNA-FISH探针（绿色）和DAPI（蓝色）结合的免疫荧光图像示例。比例尺为5μm。k个所示DNA-FISH探针与核仁的距离（微米）。统计学显著性(对-值）使用未配对的双尾t吨测试（****<0.0001）。我显示至少一个与核仁接触的DNA-FISH探针信号的细胞数量的量化。数据来自每种情况下70-120个细胞的测量结果。源数据以源数据文件的形式提供。

**图3。抑制染色质状态的不同层根据它们与核仁、核膜或两者的相互作用来区分基因组域。**
一维恩图显示了Nucleolar-DamID识别的NAD中仅NAD和NAD/LAD区域的比例。b条维恩图显示了ESC的LAD中仅LAD和NAD/LAD区域的比例。**c（c）**在ESCs中仅在NAD和NAD/LAD边界绘制的Lamin B1-DamID得分。天总基因组、NAD亚类和仅LAD的基因密度。**e（电子）**A和B隔间中仅NAD、仅LAD和NAD/LAD的数量（%）。**（f）**NAD-only、LAD-only和NAD/LAD序列的早期和晚期复制DNA的数量（%）。克A隔间（A Comp.）、仅NAD、仅LAD和NAD/LAD内基因的表达值（RPKM）。统计显著性(对-值）使用未配对的双尾t吨测试（***<0.001）。方框图描述了最小值和最大值。方框内的水平线表示平均值。小时位于A隔室（A Comp.）和仅NAD、仅LAD和NAD/LAD区域的基因组区域的活性组蛋白标记（H3K4me3、H3K27ac、H3K4me1）和抑制性组蛋白标记的水平。本分析中使用的数据集列在补充数据12中。数值显示为平均RPKM。统计显著性(对-值）使用未配对的双尾t吨试验（*<0.05，***<0.001，***<0.0001，ns：无显著性）。方框图描述了最小值和最大值。方框内的水平线表示平均值。i.组蛋白修饰的占有率（平均RPKM）、Ezh2、Ring1b、CTCF和早期和晚期DNA复制分别绘制在NAD仅（橙色车道）、NAD/LAD（蓝色线）和NAD/LAD（灰色线）的边界上。源数据作为源数据文件提供。

**图4。rRNA基因的染色质状态调节核仁附近序列的H3K9me2水平。**
一qRT-PCR显示转染pRNA或RNA对照的ESCs中45个S前rRNA水平。数值标准化为*β-肌动蛋白*mRNA和转染RNA对照的ESCs。数据来自两个独立的实验。b条用pRNA或RNA对照转染的ESCs中的H3K9me2和H3K9me3-ChIP。数据通过qPCR进行测量，并归一化为输入和ESC+RNA对照。数据来自两个独立的实验。**c（c）**在ESCs中添加pRNA导致几个基因组区域的H3K9me2增加。散点图显示了ESC+pRNA和ESC+RNA控制之间的H3K9me2和H3K9 me3水平（读取/20 kb bin）。天染色体相互作用图显示了与ESC+RNA对照相比，ESC+pRNA中H3K9me2水平增加的区域的分布。**e（电子）**rRNA基因的异染色质化促进了邻近NAD区域H3K9me2的扩增。在NAD-only、LAD-only和NAD/LAD边界上绘制的ESC+pRNA与ESC+RNA对照的H3K9me2倍变化。**（f）**具有代表性的图像显示了NAD邻近区域H3K9me2的增加。源数据作为源数据文件提供。

**图5。ESC和NPC在核仁周围的染色体组织不同。**
一Nucleolar-DamID。ESCs和NPC中NAD的染色体视图。NAD以对数表示₂H2B-Dam-NoLS和H2B-Dam之间m6A水平的比率。iNAD：不接触核仁的区域。iLAD：不与NL接触的区域。显示染色体4和11。b条显示18号染色体rDNA接触的HiC评分的代表性图像，其中包含rRNA基因和7号染色体。**c（c）**,天NPC与核仁的基因组接触比ESC更频繁。rDNA联系人的HiC评分(**c（c）**)NAD的Nucleolar-DamID值(天)在ESC和NPC中。统计显著性(对-值）使用未配对的双尾t吨测试（****<0.0001）。方框图描述了最小值和最大值。方框内的水平线表示平均值。**e（电子）**ESCs比NPC有更多的rDNA接触。ESCs和NPC染色体上唯一rDNA接触的数量。**（f）**相对于ESC，rDNA接触富集于NPC染色体的着丝粒近端区域。为了进行更好的比较，图2f中的ESC数据与NPC数据一起绘制。值表示每个染色体五分位rDNA接触者的比例。统计显著性(对-值）使用未配对的双尾t吨测试（****<0.0001）。克ESC的代表性图像_特殊用途-和NPC_特殊用途-rDNA接触及其A和B室的特征向量值。B到A和A到B代表隔间的开关。B到B和B到B表示ESC和NPC之间的特征向量值减少或增加。小时电子稳定控制系统_特殊用途-和NPC_特殊用途-rDNA接触位于抑制性B区。ESC金额（%）_特殊用途-和NPC_特殊用途-rDNA在A和B区接触。我值表示ESC的数量_特殊用途-和NPC_特殊用途-rDNA接触及其在ESC和NPC的A和B区的相应位置。j个显示ESC特征向量值的方框图_特殊用途-和NPC_特殊用途-rDNA在活性A区和抑制性B区接触。统计显著性(对-值）使用成对的双尾t吨测试（****<0.0001）。方框图描述了最小值和最大值。方框内的水平线表示平均值。源数据作为源数据文件提供。

**图6。细胞型特异性NAD的染色质特征。**
一ESC覆盖范围_特殊用途-和NPC_特殊用途-ESC和NPC中的NAD类型。文氏图表示ESC的比例_特殊用途-和NPC_特殊用途-NAD仅在ESC和NPC中分为iNAD/iLAD和LAD。右侧面板。模型仅显示ESCsp-NAD和-NAD/LAD在ESC和NPC中的位置。虚线箭头表示ESC的重新定位_特殊用途-在鼻咽癌中失去与核仁相互作用的NAD。b条ESC覆盖范围_特殊用途-和NPC_特殊用途-ESCs和NPC中的LAD类型。文氏图表示ESC的比例_特殊用途-和NPC_特殊用途-LAD类型为iNAD/iLAD，仅在NPC和ESC中为NAD。右侧面板。仅显示ESCsp LAD和-NAD/LAD在ESCs和NPC中的位置的模型。点箭头表示ESC的重新定位_特殊用途-LAD在NPC中失去了与NL的交互作用。**c（c）**根据组蛋白在NPC中的位置，ESCsp-NAD和ESCs中-NAD/LAD的组蛋白修饰水平。值为平均RPKM。统计显著性(对-值）使用未配对的双尾t吨试验（*<0.05，***<0.001，***<0.0001，ns：无显著性）。方框图描述了最小值和最大值。方框内的水平线表示平均值。天根据其在NPC中的位置，ESCsp-LAD和ESCs中-NAD/LAD的组蛋白修饰水平。值为平均RPKM。统计显著性(对-值）使用未配对的双尾t吨试验（*<0.05，***<0.0001，ns：无显著性）。方框图描述了最小值和最大值。方框内的水平线表示平均值。**e（电子）**ESC代表形象_特殊用途-ESC和NPC中A和B室的NAD及其特征向量值。箭头突出显示ESC和NPC之间特征向量值的变化。B到A代表从B（ESC）到A（NPC）隔间的区域切换。B到B和a到a表示ESC的特征向量值高于NPC。**（f）**显示ESC特征向量值的方框图_特殊用途-NAD、ESC_特殊用途-LAD、NPC_特殊用途-NAD和NPC_特殊用途-ESC和NPC中的LAD分别成为仅LAD、仅NAD以及NPC和ESC中的iNAD/iLAD。统计显著性(对-值）使用未配对的双尾t吨测试（****<0.0001）。方框图描述了最小值和最大值。方框内的水平线表示平均值。源数据作为源数据文件提供。

**图7。NAD从核仁中分离，解锁基因，以便在分化的后期激活。**
一散点图显示ESC和NPC之间的表达水平。位于ESC的基因表达_特殊用途-和NPC_特殊用途-rDNA触点分别以橙色和品红色突出显示，而总基因以黑色表示。虚线表示RPKM值为1。b条ESC基因的前10个基因本体术语_特殊用途-rDNA联系人。**c（c）**散点图显示ESC和NPC之间的基因表达水平。位于ESC的基因表达_特殊用途-仅NAD和ESC_特殊用途-在NPC中成为仅LAD或iNAD/iLAD的NAD/LAD。位于ESC的基因_特殊用途-NAD以橙色突出显示，而总基因以黑色表示。虚线表示RPKM值为1。天位于ESC的基因数量_特殊用途-全国广告部和全国人大_特殊用途-北美。指出ESCs和NPC中低表达或不表达（<1 RPKM）和表达基因的比例。**e（电子）**ESC基因的表达水平_特殊用途-NAD仅在NPC中成为iNAD/iLAD。数值来自ESC或NPC中表达的基因（>RPKM 1）。统计显著性(对-值）使用成对的双尾t吨测试（****<0.0001）。源数据作为源数据文件提供。

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1. Dekker J，Misteli T.长程染色质相互作用。冷泉港。透视。生物.2015；7:a019356。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Kempfer，R.和Pombo，A.绘制3D染色体结构的方法。《自然科学评论》第21207–226期（2019年）。-公共医学

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[7] Dekker J，Misteli T.长程染色质相互作用。冷泉港。透视。生物.2015；7:a019356。-项目管理咨询公司-公共医学

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[9] Kempfer，R.和Pombo，A.绘制3D染色体结构的方法。《自然科学评论》第21207–226期（2019年）。-公共医学

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