Bone marrow-independent adventitial macrophage progenitor cells contribute to angiogenesis

doi:10.1038/s41419-022-04605-2

.2022年3月9日；13(3):220.

doi:10.1038/s41419-022-04605-2。

骨髓依赖性外膜巨噬细胞祖细胞促进血管生成

附属公司

¹德国乌尔兹堡科尔利克斯特拉大学解剖与细胞生物学研究所，邮编：697070。
²Medizinische Klinik und Poliklinik I，德国慕尼黑，路德维希·马克西米利安大学，马尔基奥尼主义学院1581377。
^三维尔茨堡大学解剖学和细胞生物学研究所，德国维尔茨堡Koellikerstraße 6190700。uwe.rueckschloss@uni-wuerzburg.de。

^#贡献均等。

PMID： 35264563
预防性维修识别码： PMC8907187号
内政部： 10.1038/s41419-022-04605-2

骨髓依赖性外膜巨噬细胞祖细胞促进血管生成

弗洛里安·克莱费尔德等。细胞死亡病. 2022.

.2022年3月9日；13(3):220.

doi:10.1038/s41419-022-04605-2。

附属公司

¹德国乌尔兹堡科尔利克斯特拉大学解剖与细胞生物学研究所，邮编：697070。
²德国慕尼黑Marchionistrasse 15号，邮编81377，路德维希·马克西米利安斯大学，梅迪齐尼谢·克里尼克和波利克里克一世。
^三德国乌尔兹堡科尔利克斯特拉大学解剖与细胞生物学研究所，邮编：697070。uwe.rueckschloss@uni-wuerzburg.de。

^#贡献均等。

PMID： 35264563
预防性维修识别码： PMC8907187号
内政部： 10.1038/s41419-022-04605-2

摘要

病理性血管生成促进肿瘤生长、转移和动脉粥样硬化斑块破裂。巨噬细胞是这些过程中的关键参与者。然而，这些巨噬细胞是从骨髓源性单核细胞还是从局部血管壁旁干细胞和祖细胞（VW-SC）分化出来，这是一个尚未解决的血管生成问题。为了回答这个问题，我们在小鼠主动脉环试验（ARA）中分析了血管萌芽和主动脉细胞群的变化。ARA培养可产生大量巨噬细胞，尤其是在主动脉外膜内。使用免疫组织化学命运图和体内遗传标记方法，我们发现60%的巨噬细胞与骨髓依赖性Ly6c分化⁺/Sca-1型⁺外膜祖细胞。NCX分析^-/-遗传缺乏胚胎循环和卵黄囊灌注的小鼠模型表明，至少其中一些祖细胞产生卵黄囊依赖性。巨噬细胞是ARA中VEGF的主要来源，反过来促进额外巨噬细胞的产生，从而产生促血管生成的前馈回路。此外，巨噬细胞衍生的VEGF激活CD34⁺外膜血管生成区内的祖细胞分化为CD31⁺内皮细胞。因此，巨噬细胞的耗竭和VEGFR2拮抗显著降低ARA中的血管萌芽活性。总之，我们发现血管生成激活可诱导巨噬细胞从骨髓源性和骨髓依赖性VW-SC分化。后者也至少部分依赖于卵黄囊。这些VW SC衍生的巨噬细胞对血管生成有重要贡献，使其成为干扰癌症和动脉粥样硬化中病理性血管生成以及缺血性心血管疾病中再生血管生成的有吸引力的靶点。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

**图1。F4/80的生成⁺ARA中的巨噬细胞。**
一对小鼠主动脉的交叉部分进行免疫染色，作为成熟巨噬细胞F4/80的标记物。在国际汽联，几乎没有F4/80⁺可以找到巨噬细胞。ARA后几F4/80⁺内膜内出现巨噬细胞。然而，在外膜内，F4/80的数量⁺巨噬细胞大量增加。与对照组相比，用含氯膦酸脂质体处理的培养主动脉环显示几乎没有F4/80免疫染色，因为F4/80的有效耗竭⁺外膜内的巨噬细胞。b条外膜F4/80数量的统计分析⁺有和没有脂质体治疗的巨噬细胞。与含有氯膦酸盐的脂质体相比，含有PBS的脂质体的应用具有不太明显的效果。细胞计数标准化为总培养基面积(n个 = 7–10).c（c）使用或不使用氯膦酸钠治疗的培养主动脉环的相控图像和萌芽面积的量化。含有氯膦酸盐的脂质体对巨噬细胞的消耗减少了总细胞发芽和毛细血管样管的形成(n个 = 23–31). *对 < 0.05; ***对 < 0.001. 比例尺：英寸一100µm，英寸**c（c）**500微米。ARA主动脉环测定，ARA+CL-ARA与含氯膦酸的脂质体，ARA+PBS-ARA与含PBS的脂质体。

**图2。ARA中的大多数巨噬细胞来源于骨髓依赖性祖细胞。**
一通过免疫荧光分析新分离的小鼠主动脉的交叉截面，以确定是否存在Ly6c⁺和Sca-1⁺祖细胞。在外膜内，Ly6c的大部分⁺共同表达Sca-1的细胞与Ly6c的区别⁺来源于骨髓并在外周血中循环的单核细胞。b条ARA后，通过免疫荧光分析小鼠主动脉横截面是否存在Ly6c⁺/80层/四层⁺细胞。大多数F4/80⁺巨噬细胞也表达Ly6c，表明其来源于Ly6c⁺祖细胞。**c（c）**FlkSwitch小鼠培养主动脉环横截面的共焦图像。对这些部分进行F4/80筛查⁺细胞（红色免疫荧光）和eGFP+细胞（骨髓衍生）。这些部分的定量分析(n个 = 6）证实40%的F4/80巨噬细胞来源于骨髓源性细胞（F4/80⁺/电子GFP⁺)而60%来自骨髓依赖性祖细胞（F4/80⁺/GFP公司^-). 比例尺：英寸一,b条100µm，英寸**c（c）**50微米。

**图3。主动脉相关祖细胞可能部分依赖于卵黄囊。**
横向截面的共焦图像*NCX1系列*^−/−小鼠胚胎（E9.5）CD34和Sca-1免疫染色。CD34的存在⁺/Sca-1型⁺这些胚胎主动脉区周围的细胞缺乏与卵黄囊相连的功能性血管网，表明这些祖细胞来源于卵黄囊。比例尺：低倍率50µm，高倍率10µm；NT神经管，主动脉。

**图4。巨噬细胞耗竭阻止血管生成区的激活和CD31的生成⁺ARA中的内皮细胞。**
一对小鼠主动脉的交叉切片进行了祖细胞标记CD34的免疫染色。在国际汽联，大量CD34⁺血管外膜的血管生成区内存在祖细胞。通过执行ARA，这些细胞在外膜干细胞龛内被激活并分化，从而失去CD34免疫反应性。巨噬细胞的耗竭保留了CD34的数量⁺ARA期间外膜内的细胞。b条外膜CD34数量的统计分析⁺有无脂质体处理的细胞。细胞计数标准化为总培养基面积(n个 = 6–12).c（c）对小鼠主动脉的交叉部分进行内皮细胞标记物CD31的免疫染色。在国际汽联，CD31⁺细胞如预期的那样出现在内膜内（箭头），但外膜几乎完全没有细胞。ARA后，大量CD31⁺外膜内出现细胞（箭头所示）。巨噬细胞的耗竭在很大程度上阻止了它们的生成。d日外膜CD31数量的统计分析⁺有无脂质体处理的细胞。细胞计数标准化为总培养基面积(n个 = 3–10).e（电子）在第3天对培养主动脉环的交叉切片进行CD34和CD31免疫染色。CD34型⁺/CD31型⁺细胞代表CD34分化的过渡阶段⁺CD31的外膜祖细胞⁺内皮细胞*对 < 0.05; ***对 < 0.001. 比例尺：英寸一和**c（c）**100µm，英寸**e（电子）**50微米。FIA新鲜分离主动脉，ARA主动脉环测定，ARA+CL-ARA与含氯膦酸的脂质体，ARA+PBS-ARA与含PBS的脂质体。

**图5。巨噬细胞和CD34中VEGF/VEGFR2的表达⁺ARA中的祖细胞。**
一对小鼠主动脉的横截面进行促血管生成因子VEGF的免疫染色。在FIA中，VEGF主要由内膜细胞（箭头）和介质中的细胞表达。在ARA中，VEGF的数量⁺细胞大量增加，尤其是在外膜内（箭头所示）。巨噬细胞的耗竭在很大程度上阻止了这种增加。b条血管外膜VEGF数量的统计分析⁺有无脂质体处理的细胞。细胞计数标准化为总培养基面积(n个 = 6–8).c（c）通过共聚焦免疫荧光分析培养主动脉环的交叉截面，以确定是否存在VEGF⁺和F4/80⁺单元格。几乎所有对VEGF共表达F4/80高度阳性的外膜细胞。d日此外，F4/80⁺培养主动脉环横切面上的细胞共同表达VEGFR2。**e（电子）**,**（f）**同样，在国际汽联Ly6c的横截面中⁺和CD34⁺共聚焦免疫荧光显微镜显示，祖细胞至少部分共表达VEGFR2*对 < 0.05; ***对 < 0.001. 比例尺：100µm。FIA新鲜分离主动脉，ARA主动脉环测定，ARA+CL-ARA与含氯膦酸的脂质体，ARA+PBS-ARA与含PBS的脂质体。

**图6。巨噬细胞衍生的VEGF激活血管生成区并促进巨噬细胞的生成。**
一ARA后，大量F4/80⁺在VEGFR2拮抗剂ZM323881（1µM）存在下，ARA后生成巨噬细胞，但几乎没有检测到任何巨噬细胞。对于量化，F4/80覆盖的介质周长分数⁺细胞被分析(n个 ≥ 5).b条此外，应用ZM323881（1µM）可以保存CD34⁺外膜血管生成区内的细胞。为了量化，CD34覆盖的介质周长的分数⁺细胞被分析(n个≥4).c（c）因此，在ZM323881（1µM；n个 = 31). *对 < 0.05. 比例尺：100µm，相位对比度500µm。ARA主动脉环测定。

**图7。外膜细胞在血管生成激活中的相互作用。**
在ARA中，大多数巨噬细胞来源于常驻的骨髓依赖性细胞和至少部分来源于卵黄囊依赖性Ly6c⁺/Sca-1型⁺外膜祖细胞。巨噬细胞释放的VEGF一方面通过刺激CD34的分化诱导血管生成发芽⁺外膜血管生成区内的祖细胞进入CD31⁺内皮细胞。另一方面，巨噬细胞衍生的VEGF通过前馈回路中的VEGF/VEGFR2信号增强巨噬细胞的生成，从而维持血管生成过程。

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1. Carmeliet P.生命、疾病和医学中的血管生成。自然。2005年；438:932–6.-公共医学
1. Gariano RF，Gardner TW。发育和疾病中的视网膜血管生成。自然。2005年；438:960–6.-公共医学
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