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.2022年2月10日9:797137。
doi:10.3389/fcvm.2022.797137。 eCollection 2022年。

ADAMTS8通过激活EGFR依赖通路部分促进心肌纤维化

查雅芳 1, 李燕燕 2, 卓旺阁 2, 王健（Jian Wang） 1, 余洪郊 1, 张佳彦 1, 张松 1
附属公司

ADAMTS8通过激活EGFR依赖通路部分促进心肌纤维化

查亚芳等。 前心血管内科. .

摘要

心肌梗死或压力过载会导致心脏纤维化，这是心力衰竭的主要原因。据报道，ADAMTS8（一种具有血小板反应蛋白基序8的去整合素和金属蛋白酶）与许多纤维化相关疾病有关。然而，ADAMTS8在心肌梗死或压力过载引起的心肌纤维化中的具体作用尚不清楚。本研究旨在探讨ADAMTS8在心肌纤维化中的作用及其机制。扩张型心肌病患者ADAMTS8表达显著增加；其在心肌梗死和TAC大鼠模型中的表达也增加，伴随着α-SMA和胶原蛋白1的表达增加。腺病毒介导的ADAMTS8通过心脏过度表达就地注射可加重心肌梗死大鼠模型的心肌纤维化和心功能受损。此外，体外研究表明，ADAMTS8促进心脏成纤维细胞的活化；ADAMTS8作为旁分泌介质，允许心肌细胞和成纤维细胞间接沟通。我们的研究结果表明，ADAMTS8可以损伤心脏成纤维细胞的线粒体功能，然后激活PI3K-Akt通路和MAPK通路，促进YAP表达上调，EGFR位于该通路上游。本研究系统地揭示了ADAMTS8在心肌纤维化中的促纤维化作用，并探讨了其作为治疗心肌纤维化和心力衰竭的潜在靶点的作用。

关键词：ADAMTS8；EGFR通路；心肌纤维化；心力衰竭；肌成纤维细胞。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

数字

图1
图1
伴有严重心肌纤维化的扩张型心肌病患者ADAMTS8表达增加。（A、B）代表性Masson染色（比例尺=100μm）和纤维化定量。（C、D）DCM患者和正常心脏心室间隔中ADAMTS8、α-SMA和胶原蛋白1表达的代表性western印迹和定量。（E）DCM患者和正常心脏（比例尺=40μm）心室间隔ADAMTS8和Vimentin的免疫荧光染色。数据以平均值±SEM表示***P（P）与正常组相比<0.001。
图2
图2
心肌梗死大鼠模型中ADAMTS8表达增加与心脏纤维化有关。（A）心肌梗死大鼠模型心脏的典型Masson染色图像（比例尺=100μm）。（B）心肌梗死后指定时间点边缘区和边远区ADAMTS8蛋白表达的变化。（C）大鼠心脏梗死区和边缘区α-SMA和胶原蛋白I表达的Western blotting和量化。（D）ADAMTS8（绿色）和波形蛋白（红色）双重免疫荧光染色的代表性图像（比例尺=200μm）。（E、F）评估缺氧条件下12、24和48小时心肌细胞和心肌成纤维细胞中ADAMTS8蛋白水平通过西方印迹法。数据以平均值±SEM表示*P（P）<0.05 vs.0天（Sham）**P（P）与0天（Sham）或ctrl组相比，<0.01。
图3
图3
在TAC诱导的心肌纤维化大鼠模型中，ADAMTS8表达增加。（A，B）来自假心脏和TAC诱导心脏的代表性天狼星红和马森染色图像（比例尺=200μm）。（C）正常和TAC诱导大鼠ADAMTS8（绿色）和波形蛋白（红色）的免疫荧光染色（比例尺=100μm）。（D）假手术组和TAC模型组的ADAMTS8、α-SMA和胶原蛋白1表达通过western印迹并根据免疫印迹定量。（E、F）经PBS或Ang-II治疗的心肌细胞和心肌成纤维细胞中ADAMTS8蛋白水平。数据以平均值±SEM表示**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001 vs.假手术。
图4
图4
ADAMTS8促进肌成纤维细胞形成体外.（A）qPCR和western blotting检测ADAMTS8三种不同干扰序列的敲除效率。（B）通过荧光和Western blotting验证ADAMTS8的过表达效率。（C、D）检测感染ADAMTS8-过表达腺病毒或si-ADAMTS8的培养心脏成纤维细胞中α-SMA、胶原蛋白I和CTGF的水平通过西方印迹法。（E）免疫荧光检测α-SMA（红色）和细胞核（DAPI：蓝色）的表达（标尺=20μm）。数据以平均值±SEM表示*P（P）<0.05时**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，NS与Ctrl或两组之间无显著性差异。
图5
图5
ADAMTS8介导心肌细胞和心脏成纤维细胞之间的相互作用。（A）伤口修复测定，以评估与用ADAMTS8过表达腺病毒（Ad-ADAMTS8-co）或siRNA（si-ADAMTS8-co）转染的心肌细胞共培养的心脏成纤维细胞的迁移能力。（B）Transwell迁移分析和迁移心脏成纤维细胞的量化（比例尺=50μm）。（C）通过CCK-8分析进行定量(n个=每组4人）。（D、E）检测与转染ADAMTS8过表达腺病毒（Ad-ADAMTS8-co）或siRNA（si-ADAMTS4-co）的心肌细胞共同培养的心脏成纤维细胞中p27kip1和PCNA的水平通过西方印迹法。数据以平均值±SEM表示*P（P）<0.05时**P（P）<0.01，以及***P（P）两组之间<0.001。
图6
图6
ADAMTS8介导心脏成纤维细胞线粒体功能障碍并激活ROS敏感性通路以调节纤维化反应。（A、C）感染si-ADAMTS8或ADAMTS8-过表达腺病毒的培养心脏成纤维细胞中DRP-1（p-drp1）在Ser637和总drp1（t-drp1。（B）感染si-ADAMTS8的培养心脏成纤维细胞Mfn1和Mfn2 mRNA的实时聚合酶链反应（RT-PCR）分析。平均表达值归一化为GAPDH mRNA。（D）用ADAMTS8过表达腺病毒感染的培养的心脏成纤维细胞中NOX4 mRNA的RT-PCR分析的平均表达值被标准化为GAPDH mRNA。（E）感染ADAMTS8-过表达腺病毒的CFs的二氢乙硫醚（DHE）染色的代表性图像。（F、G）培养的心脏成纤维细胞中MAPK和AKT的激活检测到ADAMTS8过表达或下调通过西方印迹法。（H）培养的心脏成纤维细胞感染ADAMTS8过表达腺病毒，在静止后用MAPK途径抑制剂SB203580或AKT抑制剂LY294002处理（25 uM），然后用指示的抗体分析细胞裂解物。数据以平均值±SEM表示*P（P）<0.05时**P（P）<0.01，以及***P（P）两组之间<0.001。
图7
图7
ADAMTS8激活了YAP，抑制EGFR表达阻断了ADAMTS8-诱导的培养心肌成纤维细胞中YAP的激活。（A、B）吉非替尼组EGFR及其下游MAPK和AKT的磷酸化水平均减弱。（C）EGFR抑制剂减轻了ADAMTS8诱导的心脏成纤维细胞活化。（D）与转染ADAMTS8过表达腺病毒（Ad-ADAMTS8-co）的心肌细胞共同培养的心脏成纤维细胞用或不用吉非替尼处理，然后用指示的抗体分析细胞裂解产物。（E）维替泊芬组胶原蛋白1和α-SMA的蛋白水平均部分下降。（F）与感染ADAMTS8过表达腺病毒的心肌细胞共同培养的心脏成纤维细胞在静止后用MAPK途径抑制剂SB203580或AKT抑制剂LY294002处理，然后用指示的抗体分析细胞裂解产物。
图8
图8
ADAMTS8过度表达促进心脏纤维化和心功能受损体内.（A–C）Ad-v Sham、Ad-ADAMTS8 Sham、Adv-v MI和Ad-ADATS8 MI大鼠梗死边缘区天狼星红和Masson染色的代表性图片以及间质纤维化区域的定量分析（比例尺=50μm）。（D）Ad-v Sham、Ad-ADAMTS8 Sham、Adv-v MI和Ad-ADATS8 MI组的代表性M模式图像；EF被量化通过超声心动图。（E）Collage1和α-SMA的表达水平通过蛋白质印迹进行定量。（F）检测腺病毒注射后MI大鼠模型EGFR、MAPK和AKT信号通路的激活通过西方印迹法体内数据表示为平均值±SEM**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001,#P（P）< 0.05,##P（P）<0.01，NS表示两组之间无显著性差异。
图9
图9
甲苯咪唑下调ADAMTS8，改善心脏纤维化和心力衰竭。（A）用甲苯咪唑（5mol/L）处理48 h后心脏成纤维细胞的典型Western blot和ADAMTS8定量(n个=3个）。（B）使用或不使用甲苯咪唑治疗的CFs中ADAMTS8、PCNA、p27kip1、α-SMA和Collage1表达的典型Western blot和定量(n个=3个）。（C）MI或TAC后用赋形剂或甲苯咪唑治疗14天的大鼠左心室中ADAMTS8、α-SMA和Collagen1蛋白水平的代表性蛋白质印迹(n个=5个）。（D）大鼠梗死边缘区天狼星红和马森染色的代表性图片，心肌梗死后21天用溶媒或甲苯咪唑治疗（比例尺=100μm）。（E、F）心肌梗死后28天获得的典型M型超声心动图。通过检测心肌梗死后EF%、FS%、LVDD和LVSD来测量心功能。数据以平均值±SEM表示***P（P）< 0.001,##P（P）<0.01和###P（P）两组之间<0.001。
图10
图10
说明ADAMTS8通过缺氧和Ang-II刺激介导EGFR信号通路的激活。
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引用人

参考文献

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