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.2022年2月21日；135(5):606-618.
doi:10.1097/CM9.0000000000002018。

配对盒5通过促进p53信号活性提高食管鳞癌细胞的化疗敏感性

张伟伟（Weiwei Zhang） 1 2, Wenji Yan公司 三, 钱念松（Niansong Qian） 4, 全利·韩 三, 张伟涛 5, 广海戴 三
附属公司

配对盒5通过促进p53信号活性提高食管鳞癌细胞的化疗敏感性

张伟伟（Weiwei Zhang）等。 中国医学杂志（英文）. .

摘要

背景：基因启动子甲基化是癌症中一种主要的表观遗传改变，在致癌过程中起着关键作用。作为B细胞分化和胚胎神经发育早期的关键调节因子，配对盒5（PAX5）基因在几种肿瘤中被甲基化下调，这种下调在食管鳞癌（ESCC）发病机制中的作用尚不清楚。

方法：为了阐明PAX5在食管鳞癌中的作用，研究了8个食管鳞癌细胞系、51个初级食管鳞癌组织样品和8个正常食管粘膜样品，并查询了癌症基因组图谱（TCGA）。通过逆转录聚合酶链反应和western blotting检测PAX5的表达。在PAX5过度表达或沉默的ESCC细胞系中，通过流式细胞术、集落形成分析和3-（4,5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二苯基-2-氢四唑溴化物分析检测细胞凋亡、增殖和化疗敏感性。建立肿瘤异种移植模型进行体内验证。

结果：PAX5甲基化在37.3%（19/51）的原发性ESCC样本中发现，这与年龄（P=0.007）和肿瘤结节转移期（P=0.014）显著相关。TCGA数据分析表明，PAX5表达与启动子区甲基化呈负相关（cg00464519的r=-0.189，P=0.011，cg02538199的r=0.228，P=0.002）。PAX5表达的恢复抑制了ESCC细胞系的细胞增殖，促进了凋亡，并抑制了肿瘤生长，这在异种移植小鼠中得到了验证。异位PAX5表达显著增加了p53报告荧光素酶活性，并提高了p53信使RNA和蛋白水平。染色质免疫沉淀分析证实PAX5与p53启动子区直接相互作用。PAX5的再表达使ESCC细胞系KYSE150和KYSE30对氟尿嘧啶和多西他赛敏感。沉默PAX5可诱导KYSE450细胞对这些药物的耐药性。

结论：PAX5作为一种受人类ESCC启动子区甲基化调控的抑癌基因，抑制增殖，促进凋亡，并诱导p53信号的激活。PAX5可以作为ESCC的化学敏感性标记。

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无。

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图1
图1
PAX5型ESCC细胞系中的表达与DNA甲基化呈负相关。（A） 中的CpG岛示意图PAX5型使用MethPrimer工具生成的启动子区域(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprierr.cgi). （B） 甲基化状态PAX5型在EC细胞系中用MSP检测到启动子区。以IVD为阳性对照，NL-DNA为阴性对照，验证引物效率。（C） BSSQ分析PAX5型启动子区在KYSE450、TE10和KYSE150细胞系中进行。双头箭头表示MSP检查的CpG岛区域（105 bp）。实心圆圈表示甲基化的CpG位点PAX5型启动子区CpG岛。开放圆圈表示未甲基化的CpG位点。BSSQ的重点是该岛上游161-bp（−297至−136 bp）的CpG岛屿PAX5型转录起始位点。（D） mRNA表达PAX5型通过定量RT-PCR对8个ESCC细胞系（KYSE30、KYSE150、KYSE70、KYSE250、TE7、TE3、KYSA140和TE10）进行分析。（E） 信使核糖核酸表达水平PAX5型在暴露于DAC（+）96小时或阴性对照（-）后，通过半定量RT-PCR对KYSE150、KYSE30和KYSE450细胞系进行分析。BSSQ：亚硫酸氢盐测序；BSSQ-F：亚硫酸氢盐测序正向引物；BSSQ-R：亚硫酸氢盐测序反向引物；CpG：胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸；DAC：5-氮杂-2-脱氧胞苷；EC：食管癌；食管鳞癌；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；体外诊断：体外-甲基化DNA；M： 甲基化等位基因；MF:MSP正向底漆；MR:MSP反向引物；mRNA：信使RNA；MSP：甲基化特异性聚合酶链反应；NL：正常淋巴细胞；PAX5型：配对框5；U： 非甲基化等位基因；UF：未甲基化前向底漆；UR：非甲基化反向引物；逆转录聚合酶链反应；TSS：转录起始点。
图2
图2
的表达和甲基化状态PAX5型在食管鳞癌组织中。（A） 代表性MSP结果PAX5型NE粘膜和ESCC组织中启动子区甲基化状态。以IVD为阳性对照，NL-DNA为阴性对照，验证引物效率。（B） 左：的单变量散点图PAX5型食管鳞癌组织中mRNA表达水平(n个=================================================================================179)与.相邻组织样本(n个=================================================================================8） 使用来自TCGA和GTEx数据库的RNA-Seq数据。PAX5型mRNA表达（纵轴）表示为log2（TPM+1），其中TPM是每百万（读取）的转录物的值。右：的表达式PAX5型8例食管鳞癌组织与配对相邻组织样本进行比较。P（P）>未配对和配对样本均为0.05。（C） 前两个CpG位点（分别为cg00464519和cg02538199）的甲基化状态与PAX5型在179例食管鳞癌中表达（全部P（P）< 0.05). （D） 中cg00464519和cg02538199的甲基化水平PAX5型ESCC组织（T）和相邻组织样本（A）的启动子差异显著(P（P）< 0.05). （E） Kaplan–Meier曲线显示ESCC患者5年OS与PAX5型mRNA表达(对> 0.05). （F） Kaplan-Meier曲线显示了5年OS的相关性(n个=================================================================================181）在甲基化状态为PAX5型启动子位于两个CpG位点cg02538199和cg00464519。CpG：胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸；食管鳞癌；GTEx：基因型问题表达；体外诊断：体外-甲基化DNA；M： 甲基化带；mRNA：信使RNA；MSP：甲基化特异性聚合酶链反应；NE：食管正常；NL：正常淋巴细胞；OS：总生存率；PAX5型：配对框5；U： 非甲基化带。
图3
图3
的影响PAX5型对ESCC细胞增殖和凋亡的影响。（A） 具有代表性的WBs显示异位表达的效率PAX5型在KYSE150/KYSE30细胞和PAX5型敲除KYSE450细胞。（B） 的影响PAX5型KYSE150和KYSE30细胞系修复前后菌落形成的研究PAX5型在有或无KYSE450细胞中的表达PAX5型击倒。（C） 用MTT法测定96小时的生长曲线表明PAX5型关于修复前后的增殖PAX5型在KYSE150和KYSE30细胞及KYSE450细胞株中表达PAX5型击倒。（D） WBs显示DAC对PAX5型和p53在KYSE150、KYSE30和KYSE450细胞中表达。（E） 将KYSE150、KYSE30和KYSE450细胞培养72 h。然后使用FITC BrdU流式试剂盒评估BrdU掺入，并在接种后72 h通过流式细胞仪进行分析。（F） 流式细胞术结果的影响PAX5型细胞凋亡。KYSE150和KYSE30细胞修复前后凋亡细胞百分比PAX5型以及在KYSE450细胞中PAX5型显示了击倒。（G） 流式细胞术检测DAC对细胞凋亡的影响。显示了DAC处理前后KYSE150、KYSE30和KYSE450细胞中凋亡细胞的百分比。（H） 修复前和修复后PAX5、p53和凋亡相关蛋白表达水平的代表性WB结果PAX5型在KYSE150和KYSE30细胞系中及前后的表达PAX5型敲除KYSE450细胞系。凋亡相关蛋白包括裂解caspase-3、裂解caspase-7、裂解caspase-8、裂解caspase-9、裂解PARP、前caspase-3、前caspace-7、前cascase-8，前caspase-9和PARP。GAPDH作为对照。∗P（P）< 0.01,†P（P）< 0.05,‡P（P）< 0.001. BrdU：溴脱氧尿苷；CY5：硫菁5羧酸；DAC：5-氮杂-2-脱氧胞苷；食管鳞癌；FITC：异硫氰酸荧光素；FL1-H：荧光1-高度；FL2-H：荧光2-高度；FL4-H：荧光4-高度；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；MTT：3-（4,5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二苯基-2-氢四唑溴化物；NC：阴性对照；PAX5型：配对框5；PARP：聚二磷酸腺苷核糖聚合酶；PI：碘化丙锭；sh：短发夹；WBs：蛋白质斑点。
图4
图4
的影响PAX5型ESCC细胞异种移植。（A） 的影响PAX5型KYSE150细胞异种移植瘤的生长。左图：KYSE150细胞的代表性异种移植肿瘤PAX5型通过慢病毒载体恢复与.空矢量控件。中间：异种移植物重量直方图PAX5型-表达群与矢量控制组。右图：皮下KYSE150异种移植瘤从第10天到第36天的生长曲线。（B） 的影响PAX5型KYSE30细胞异种移植瘤的生长。（C） KYSE150和KYSE30细胞移植瘤移植前后的典型TUNEL染色PAX5型转染。TUNEL阳性细胞（棕色染色细胞核）的数量在PAX5型-转染肿瘤（原始放大倍数×200）。（D） 免疫组织化学染色PAX5型在C（E）中描述的相同条件下，在C中描述的同样条件下，对p53进行免疫组织化学染色。∗P（P） < 0.001,†P（P） < 0.05. 食管鳞癌；PAX5型：配对框5；TUNEL：转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸（dUTP）-地高辛缺口末端标记。
图5
图5
PAX5型促进ESCC细胞中的p53信号活性。（A） 启动子荧光素酶检测（p53-luc）结果PAX5型-稳定转染的KYSE150和KYSE30细胞以及载体控制细胞。转染后48小时，通过双荧光素酶测定系统测定荧光素素酶活性。（B） 具有代表性的WBs显示p53蛋白在治疗前后的水平PAX5型在KYSE150和KYSE30细胞系中以及在KYSE450细胞中转染或不转染PAX5型击倒。（C） ChIP分析的结果用于研究PAX5蛋白是否与p53基因的启动子区结合。之前和之后PAX5型转染KYSE150和KYSE30细胞株后，用抗PAX5抗体免疫沉淀可溶性染色质。（D） 定量RT-PCR显示KYSE150和KYSE30前后p53 mRNA水平PAX5型在KYSE450细胞中转染或不转染PAX5型击倒。∗P（P）< 0.001,†对< 0.05. ChIP：染色质免疫沉淀；食管鳞癌；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；IgG：免疫球蛋白G；NC：阴性对照；PAX5：配对盒5；Sh：短发夹；WBs：Western blot。
图6
图6
的影响PAX5型ESCC细胞对5-FU和多西紫杉醇的化疗敏感性。（A） 不同浓度（0、6.25、12.50、25、50和100μmol/L）的5-FU对KYSE150和KYSE30细胞生长抑制作用的代表性曲线PAX5型表达。（B） 多西紫杉醇在不同浓度（0、2、4、8、16和32μmol/L）下的生长抑制效应的代表性曲线。（C） 含或不含5-FU（左）和多西紫杉醇（右）在KYSE450细胞中的生长抑制曲线PAX5型基因敲除。浓度范围如上所述。5-FU/多西紫杉醇处理48小时后，通过MTT法测定细胞活力。（D）不同浓度（0、6.25、12.50、25、50和100μmol/L）的5-FU在KYSE150和KYSE30细胞修复前和修复后的生长抑制作用的代表性曲线PAX5型有或无p53抑制剂pifithrin-μ的表达。（E） 多西紫杉醇在不同浓度（0、2、4、8、16和32μmol/L）下的生长抑制效应的代表性曲线。5-FU/多西他赛处理48小时后，通过MTT法测定细胞活力。∗P（P） < 0.001与.矢量，†P（P） < 0.01与.矢量，‡P（P） < 0.001与.sh-NC，§P（P） < 0.001与.PAX5+吡氟菊酯-μ。5-FU：氟尿嘧啶；食管鳞状细胞癌；集成电路50：半数最大抑制浓度；MTT:3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵；PAX5型：配对框5。
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引用人

  • 多效性PAX5型基因产品和功能。
    Nasri Nasrabadi P、Martin D、Gharib E、Robinchaud GA。 Nasri Nasrabadi P等人。 国际分子科学杂志。2022年9月3日；23(17):10095. doi:10.3390/ijms231710095。 国际分子科学杂志。2022 PMID：36077495 免费PMC文章。 审查。

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