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临床试验
.2022年2月；12（2）：e727。
doi:10.1002/ctm2.727。

双向正反馈通路在分子靶向治疗介导的间变性甲状腺癌细胞凋亡中的中心作用

赵启武 1, 冯浩然 1, 杨哲宇 1, 梁居庸 1, 金志坚 1, 陈凌霞 1, 凌战 1, 明轩 2, 季奇燕 1, 杰光 1, 西城 1, 任照 1, 邱伟华 1
附属机构
临床试验

双向正反馈通路在分子靶向治疗介导的间变性甲状腺癌细胞凋亡中的中心作用

赵启武等人。 临床翻译医学. 2022年2月.

摘要

背景：无定形甲状腺癌（ATC）是最具侵袭性的肿瘤之一。我们之前证实，阿帕替尼通过调节细胞死亡（RCD）对ATC具有潜在的治疗作用。作为一种新发现的RCD，焦凋亡表现出不同于凋亡或自噬的直接抗肿瘤活性。因此，本研究重点探讨ATC中细胞凋亡的临床意义、调控作用及其机制。

方法：在一项II期试验中，间变性或低分化甲状腺癌患者每天服用500毫克阿帕替尼。进行了多项检测，以评估阿帕替尼和/或蜂毒素在体内外的抗肿瘤效果。应用高通量测序分析阿帕替尼处理前后ATC细胞mRNA表达的差异。采用原位Hoechst 33342/PI双重染色、LDH释放试验和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞凋亡。在机理探索中，进行了定量RT-PCR、Western blotting和si-RNA敲除。

结果：17名患者可进行评估。阿帕替尼显示出良好的治疗效果，疾病控制率（DCR）为88.2%；然而，23.5%的患者由于无法忍受的毒性而终止了治疗。为了减少不良事件，在体外和体内治疗ATC时，发现了阿帕替尼和蜂毒肽介导的焦下垂协同抗肿瘤作用。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1-胃泌素D（GSDMD）轴介导的热下垂是阿帕替尼和蜂毒素联合应用额外抗肿瘤作用的关键。此外，除了caspase-1-GSDMD途径外，caspase-3-gasdermin E（GSDME）热解途径也发挥重要作用。体外和体内研究证明，在caspase-1-GSDMD和caspase-3-GSDME轴之间创新性地证实了双向正反馈相互作用。

结论：通过caspase-1-GSDMD和caspase-3-GSDME轴同步介导的热解作用，低剂量的阿帕替尼和蜂毒素可以协同达到类似的治疗潜力，降低AEs。更重要的是，创新性地提出了这两个轴之间的双向正反馈互动，为靶向治疗提供了新的前景。

关键词：间变性甲状腺癌；阿帕替尼；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；蜂毒素；热解；双向正反馈。

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提交人声明不存在利益冲突。

数字

图1
图1
阿帕替尼在ATC和PDTC治疗中具有良好的疗效和明显的不良反应。（A） 二期试验示意图。（B） 阿帕替尼治疗前单个患者每月靶病变直径总和的增加率。（C） 在阿帕替尼治疗期间，个体患者靶病变直径总和与基线相比的最大百分比变化。根据RECIST v1.1确定最佳肿瘤反应。（D） 两名典型的间变性甲状腺癌患者在基线、8周和16周服用阿帕替尼治疗后进行CT扫描。治疗16周后，病灶大小明显缩小。（E） 不良事件和严重不良事件的发生率（3级及以上）
图2
图2
阿帕替尼和蜂毒素在体外对ATC有协同作用。（A） 用递增浓度的阿帕替尼和/或蜂毒肽给药ATC细胞，并通过CCK-8测定评估细胞活力。（A）F类 一使用Chou–Talalay方法联合应用阿帕替尼和蜂毒素的CI图。（C和D）用阿帕替尼（20μM）和/或蜂毒素（CAL‐62为4μg/ml，C‐643为1μg/ml）处理24小时（比例尺：200μM）后，通过EdU掺入试验测量细胞增殖的定量结果和代表性图像。（E和F）用阿帕替尼（10μM）和/或蜂毒素（CAL-62为2μg/ml，C-643为0.5μg/ml）处理2周后，通过集落形成试验测量细胞增殖的定量结果和代表性图像。数据表示为平均值±SD*第页 < .05, **第页 < .01, ***第页 < .001
图3
图3
阿帕替尼和蜂毒素在体内对ATC的治疗具有协同作用。（A） 皮下注射CAL‐62细胞的异种移植小鼠肿瘤。给小鼠分别给予载体对照、低剂量阿帕替尼、标准剂量阿帕替尼、低剂量阿帕替尼联合蜂毒肽和仅蜂毒肽。（B） 每周测量肿瘤体积。（C） 小鼠处死后分析肿瘤重量。（D） HE染色、Ki‐67的IHC染色、CD31和所示治疗肿瘤的TUNEL分析的代表性图像（比例尺：50μm）。（E） 指定治疗小鼠肝脏和肾脏的HE染色代表性图像（比例尺：100μm）。黑色箭头表示肝细胞坏死和淋巴细胞浸润。红色箭头表示肾小球萎缩。数据表示为平均值±SD*第页 < .05, **第页 < .01, ***第页 < .001
图4
图4
Caspase‐1–GSDMD凋亡途径提供了阿帕替尼和蜂毒素联合的额外抗肿瘤作用。（A） 热图显示了用含有或不含有蜂毒素的阿帕替尼处理的CAL‐62中差异表达的mRNA，通过高通量RNA方程进行分析。（B） 使用RNA‐seq数据进行KEGG通路分析的结果。（C） 使用RNA‐seq数据进行世代富集分析（GSEA）的结果。（D） 用相差显微镜（比例尺：200μm）拍摄指定处理后的细胞形态代表性图像。白色箭头表示质膜上有气泡。（E） 指示处理后ATC细胞的透射电子显微照片。黑色箭头表示膜孔，白色箭头表示膜的破坏区域（比例尺：2μm）。（F） 原位Hoechst 33342/PI双重染色显示处理后ATC细胞PI阳性率的定量结果。（G） 指示治疗后ATC细胞的LDH释放水平。（H和I）IL‐1β和IL‐18在指定治疗后产生的细胞。（J） 指示治疗后细胞的典型Western印迹图像。当阿帕替尼和蜂毒素联合使用时，裂解caspase‐1和GSDMD‐N末端的蛋白质水平显著增加。无论是否应用蜂毒肽，阿帕替尼治疗后Caspase‐1均上调。（K） 用qPCR测定经指示处理后细胞中九种不同NOD样受体的mRNA转录水平。（五十） 无论是否应用阿帕替尼，蜂毒肽治疗后AIM2蛋白水平均上调。在所有检测中，ATC细胞均用阿帕替尼（20μM）和/或蜂毒素（CAL‐62为4μg/ml，C‐643为1μg/ml）处理24小时。数据表示为平均值±SD*第页 < .05, **第页 < .01, ***第页 < .001
图5
图5
除了Caspase‐1–GSDMD途径外，Caspase­3–GSDME热解途径也发挥着重要作用。（A和B）在AIM2敲除或不敲除的情况下，阿帕替尼和蜂毒肽处理的ATC细胞的LDH释放水平和IL-1β产生。（C和D）阿帕替尼和蜂毒素处理的ATC细胞PI阳性率和LDH释放水平的定量结果，VX‐765是caspase‐1的一种特异性抑制剂。（E） VX‐765以浓度依赖的方式降低了阿帕替尼和蜂毒素处理的ATC细胞中GSDMD‐N末端和裂解半胱天冬酶-1的水平。（F） 阿帕替尼和蜂毒素处理的ATC细胞在GSDMD敲除前后的LDH释放水平。（G） 当阿帕替尼和蜂毒素联合使用时，裂解caspase‐3和GSDME‐N末端的蛋白质水平也显著增加。（H和I）阿帕替尼和蜂毒素处理的ATC细胞PI阳性率和LDH释放水平的定量结果，其中Z‐DEVD‐FMK（caspase‐3的一种特异性抑制剂）的浓度升高。（J） Z‐DEVD‐FMK以浓度依赖的方式降低了阿帕替尼和蜂毒素处理的ATC细胞中GSDME‐N末端的水平。（K） 阿帕替尼和蜂毒素处理的ATC细胞在GSDME敲除前后LDH释放水平。（五十） 阿帕替尼和蜂毒素与VX‐765和/或Z‐DEVD‐FMK处理的细胞的LDH释放水平。数据表示为平均值±SD*第页 < .05, **第页 < .01, ***第页 < .001
图6
图6
创新性地提出了caspase-1–GSDMD和caspase-3–GSDME途径之间的双向正反馈相互作用。（A） VX‐765可以减少GSDME-N终端的生成，Z‐DEVD-FMK可以减少GSDMA-N终端的生成。（B） VX‐765能够以浓度依赖的方式减少caspase‐3的激活，从而减少GSDME的裂解。（C） 敲除GSDMD可降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的活性，从而导致GSDME-N末端的减少。（D） Z‐DEVD‐FMK能够以浓度依赖的方式减少caspase‐1的激活，从而减少GSDMD的裂解。（E） 敲除GSDME不能降低caspase‐1和GSDMD的激活。（F） 在CAL‐62和C‐643基因敲除克隆或用空载体转染的细胞中表达caspase‐1和caspase­3蛋白。（G） 胱天蛋白酶-1敲除降低了胱天蛋白酶-3的激活和GSDME的切割。（H） 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3敲除降低了半胱氨酸蛋白酶-1的激活和GSDMD的裂解
图7
图7
Caspase‐1–GSDMD和Caspase∙3–GSDME通路在体内协同发挥抗肿瘤作用。（A） 皮下注射CAL‐62细胞的异种移植小鼠肿瘤。用低剂量阿帕替尼和蜂毒素治疗的小鼠分别给予VX‐765、Z‐DEVD‐FMK和这两种抑制剂。（B） 每周测量肿瘤体积。（C） 小鼠处死后分析肿瘤重量。（D） 指示治疗后，肿瘤AIM2、裂解caspase‐1、GSDMD‐N末端、裂解caspase‐3和GSDME‐N终端的IHC染色平均得分。（E） ATC细胞中胱天蛋白酶-1–GSDMD和胱天蛋白酶-3–GSDME轴的主要分子机制模型的示意图。数据表示为平均值±SD*第页 < .05, **第页 < .01, ***第页 < .001
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