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.2022年2月19日；79（3）：137。
doi:10.1007/s00018-022-04137-0。

Twist1通过半乳糖凝集素-3调节巨噬细胞可塑性促进肾纤维化

吴青峰 # 1 2, 孙世仁 # 三 4, 雷伟 三, 刘敏娜（Minna Liu） 三, 郝刘 4, 刘婷（Ting Liu） 三, Ying Zhou周莹 三, 清佳 三, 狄王 三, 甄扬 三, 段梦露 三, 杨晓霞 三, 高培松 5 6, 小轩宁 7 8
附属公司

Twist1通过半乳糖凝集素-3调节巨噬细胞可塑性促进肾纤维化

吴青峰等。 细胞分子生命科学. .

摘要

肾间质纤维化是终末期肾病的病理基础，其中巨噬细胞在肾脏微环境中的异质性起着重要作用。然而，肾纤维化进展过程中巨噬细胞可塑性的分子机制尚不清楚。在这项研究中，我们首次发现，在IgA肾病患者和单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠中，巨噬细胞中Twist1表达的增加与肾纤维化的严重程度显著相关。巨噬细胞中Twist1的消融显著减轻了UUO小鼠的肾小管损伤和肾纤维化，同时伴有较低程度的巨噬细胞浸润和肾脏M2极化。Twist1的敲除至少部分抑制了巨噬细胞通过CCL2/CCR2轴的趋化性和迁移。Twist1下调抑制M2巨噬细胞极化，并减少促纤维化因子Arg-1、MR（CD206）、IL-10和TGF-β的分泌。条件性Twist1缺陷小鼠巨噬细胞中的半乳糖凝集素-3减少，Twistl可直接激活半乳糖凝素-3转录。galectin-3的上调恢复了Twist1介导的M2巨噬细胞极化。总之，Twist1/galectin-3信号调节巨噬细胞可塑性（M2表型）并促进肾纤维化。这项研究可能为延缓慢性肾脏病患者肾纤维化提供新的策略。

关键词：半乳糖凝集素-3；巨噬细胞；极化；肾纤维化；扭转1。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
Twist1信号在来自纤维化肾脏的巨噬细胞中被激活。一IgAN患者活检样本肾切片的代表性照片。HE、Masson、Col-1和a-SMA免疫染色（× 20） 3μm肾切片用于纤维化区域。条形标尺=50微米，n个=每组6个样本，n个=每只小鼠分析10张显微照片。b条IgAN患者切片中纤维化区域、总胶原含量、Col-1和α-SMA染色阳性区域的条形图分析。c（c）代表性免疫荧光（× 40）在3μm肾脏切片中检测Twist1（绿色）、CD68（红色；巨噬细胞）和DAPI（蓝色），分析显示各组间IgAN患者巨噬细胞中Twistl 1表达。d日IgAN患者巨噬细胞Twist1表达的条形图分析。e（电子）小鼠在UUO后0、3、7和14天被安乐死，免疫荧光（× 20） 用于3μm肾脏切片中的Twist1（绿色）、F4/80（红色；巨噬细胞）和DAPI（蓝色），分析显示UUO后小鼠模型巨噬细胞中的Twist1表达。条形标尺=50微米，n个=每组6个样本，n个=每只小鼠分析10张显微照片。（f）显示各组间UUO 14天小鼠巨噬细胞Twist1表达的条形图分析。克UUO 0、3、7、14天后小鼠肾巨噬细胞Twist1 mRNA丰度的实时PCR分析。n个=每组3只小鼠，n个=3个独立实验。小时UUO后14天，BMM和小鼠肾巨噬细胞Twist1表达的Western blotting。n个=每组6只小鼠，n个=3个独立实验。我RM和BMM中Twist1表达的条形图分析*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01. 数据表示为平均值 ± SEM。首先对数据进行正态分布分析，如果数据通过正态检验，则双尾Student’st吨采用两组检验和多组双向方差分析。IgAN公司IgA肾病，第1列1型胶原蛋白，α-SMAα-平滑肌肌动蛋白，BMM公司骨髓源性巨噬细胞，马来西亚令吉肾巨噬细胞
图2
图2
巨噬细胞中Twist1的缺失改善了UUO小鼠损伤后的间质纤维化。一HE、Masson、Sirus红和PAS免疫染色（× 20） 3μm肾切片分析各组UUO小鼠肾组织中的纤维化面积和总胶原含量。条形标尺=50微米，n个=每组5只动物，n个=每只小鼠分析10张显微照片。b条，c（c）纤维化面积、总胶原蛋白含量的条形图分析(b条，masson）和c（c）各组UUO小鼠肾组织中胶原III和IV染色阳性区（Sirus红）如图所示。条形标尺=50微米，n个=每组5只动物，n个=每只小鼠分析10张显微照片*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01. 数据表示为平均值 ± SEM。首先对数据进行正态分布分析，如果数据通过正态检验，则双尾Student’st吨采用两组测试和多组双向方差分析
图3
图3
消融巨噬细胞中的Twist1可减少UUO小鼠肾脏中的纤维化因子。一各组UUO小鼠肾组织中Col-1和α-SMA染色阳性区域如图所示。条形标尺=50微米，n个=每组5只动物，n个=每只小鼠分析10张显微照片。b条，c（c）Col-1的条形图分析(b条)和α-SMA(c（c）)各组UUO小鼠肾组织染色阳性区如图所示。d日UUO后14天肾组织中α-SMA和Col-1表达的Western blotting分析。e（电子），（f）Col-1的条形图分析(e（电子）)和α-SMA(（f）)UUO后14天肾组织中的相对表达Cre公司+扭转1飞行/飞行和野生型同窝小鼠*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01. 数据表示为平均值 ± SEM。首先对数据进行正态分布分析，如果数据通过正态检验，则双尾Student’st吨采用两组测试和多组双向方差分析
图4
图4
巨噬细胞中Twist1的消融保护UUO小鼠肾小管免受损伤。一肾小管上皮细胞萎缩（品红色箭头）、肾小管上皮细胞融合（蓝色允许）和线粒体空泡变性（绿色允许）的代表性电子显微镜检查螺纹1fl/fl和Cre公司 + 扭转1fl/flUUO后的小鼠。条形标尺=2微米。n个=每组3只动物，n个=每只小鼠分析3张显微照片。b条如图所示，各组UUO小鼠肾组织线粒体空泡变性（肾小管损伤的标志）的条形图分析*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01. 数据表示为平均值 ± SEM。首先对数据进行正态分布分析，如果数据通过正态检验，则双尾Student’st吨采用两组测试和多组双向方差分析
图5
图5
巨噬细胞的Twist1消融可减少UUO肾脏中巨噬细胞的蓄积。一代表性电子显微镜和b条条形图分析巨噬细胞浸润（红色箭头）Cre公司+扭转1fl/fl和野生型同窝小鼠。条形标尺=2微米。n个=每组3只动物，n个=每只小鼠分析3张显微照片，Cre公司 + 扭转1fl/fl小鼠与野生型同窝小鼠。c（c）流式细胞术和条形图分析(d日)巨噬细胞在肾组织中的浸润Cre公司 + 扭转1fl/fl在第0、3、7和14天进行UUO后，与来自野生型同窝UUO肾脏的巨噬细胞相比，n个=每组3只动物，n个=3个独立实验。e（电子）代表性免疫荧光（× 20） 用于3µm肾脏切片中的CCR2（趋化因子受体2，白色箭头）和（f）条形图分析显示CCR2在所有四组小鼠中的表达。条形标尺=50微米。n个=每组6只动物，n个=每只小鼠分析5张显微照片，WT-UUO vs.KO-UUO。克小鼠肾巨噬细胞CCL2（趋化因子配体2）mRNA丰度的实时PCR分析Cre公司 + 扭转1fl/flUUO后14天的小鼠和野生型同窝小鼠(n个=3/组，重复三次）*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01. 数据表示为平均值 ± SEM。首先对数据进行正态分布分析，如果数据通过正态检验，则双尾Student’st吨采用两组测试和多组双向方差分析
图6
图6
巨噬细胞中Twist1的消融减少了UUO肾脏中M2巨噬细胞的极化。一流式细胞术分析和b条肾组织M2巨噬细胞极化的条形图分析Cre公司 + 扭转1fl/fl和野生型同窝小鼠在0、3、7和14天，n个=每组3只动物，n个=3个独立实验，Cre公司 + 扭转1fl/fl和野生型同窝小鼠。c（c）实时PCR分析显示术后14天假肾和UUO肾巨噬细胞中Arg-1、MR、IL10和Fizz1的mRNA丰度。每个样本来自同一组内的五只动物。巨噬细胞来自克里 + 扭转1fl/fl与野生型室友UUO肾脏的巨噬细胞相比，n个=3个独立实验。d日Western blotting检测单用PBS、IFN-γ加LPS、IL-4、，n个=3个独立实验。e（电子）用siRNA-Twist1和空载体对照转染Raw264.7细胞后Twist-1和IL-10（M2巨噬细胞标记物）表达的Western blot，n个=3个独立实验。（f）实时PCR分析Twist1-沉默Raw264.7细胞、siRNA-Twist1与空载体对照中Arg-1、MR、IL-10和Fizz1的mRNA丰度，n个=3个独立实验*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01. 数据表示为平均值 ± SEM。首先对数据进行正态分布分析，如果数据通过正态检验，则双尾Student’st吨采用两组测试和多组双向方差分析
图7
图7
巨噬细胞中的Twist1缺失抑制促纤维化生长因子片段。一实时PCR分析显示术后14天从纤维化肾脏分离的巨噬细胞中PDGFA、PDGFB、PDGFC、PDGFD、TGFβ1T、TGFα2、TGFγ3、VEGFA和CCN2的mRNA丰度。每个样本都来自同一组内的五只动物，而巨噬细胞来自野生型同窝伙伴，n个=3个独立实验。b条用白细胞介素-4刺激Twist1消融小鼠和野生型同窝小鼠骨髓基质中α-SMA和Col-1的Western blot，n个=3个独立实验。c（c）条形图分析来自Cre公司 + 扭转1fl/fl白细胞介素-4刺激小鼠和野生型同窝小鼠，Cre公司 + 扭转1fl/fl小鼠与野生型同窝伴侣的比较。d日Twist1沉默的Raw264.7和IL-4刺激的对照组中α-SMA和Col-1的Western blot，n个=3个独立实验。e（电子）α-SMA和Col-1在Twist1-沉默的Raw264.7中相对表达的条形图分析，以及IL-4、siRNA-Twist1刺激的对照组与空载体对照组，n个=3个独立实验*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01. 数据表示为平均值 ± SEM。首先对数据进行正态分布分析，如果数据通过正态检验，则双尾Student’st吨对两组进行检验，对多组进行双向方差分析
图8
图8
Galectin-3是Twist 1的直接目标。一F4/80 mRNA基因序列分析+五只小鼠的肾巨噬细胞聚集在一起，n个=3个独立实验。b条实时PCR分析显示术后14天假肾和UUO肾巨噬细胞中半乳糖凝集素-3的mRNA丰度。每个样本来自同一组内的五只动物。巨噬细胞来自Cre公司 + 扭转1fl/fl与野生型室友UUO肾脏的巨噬细胞相比，n个=3个独立实验。c（c）含有野生型结合位点的半乳糖凝集素-3启动子荧光素酶报告子结构的示意图。d日将连续截短的半乳糖凝集素-3荧光素酶报告体转染到Raw264.7 siRNA-twist1（siTwist1）和Raw2647-siRNA-Control（Control）细胞中。测定并分析荧光素酶活性值。荧光素酶值归一化为空载体对照。siRNA-Twist1与空载体控制，n个=3个独立实验。e（电子）与galectin-3野生型或突变报告质粒或对照共同转染的Raw264.7细胞中的相对荧光素酶活性。将萤光素酶值标准化为空载体对照。siRNA-Twist1与空载体控制，n个=3个独立实验*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01. 数据表示为平均值 ± SEM。首先对数据进行正态分布分析，如果数据通过正态检验，则双尾Student’st吨采用两组测试和多组双向方差分析
图9
图9
扭曲1直接转录Galectin-3。一染色质免疫沉淀分析显示Twist1与Raw264.7细胞中galectin-3启动子的结合位点3-5直接结合。b条条形图表示为标准化的相对富集度，以控制IgG，n个=3个独立实验*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01. 数据表示为平均值 ± SEM。首先对数据进行正态分布分析，如果数据通过正态检验，则双尾Studentt吨采用两组测试和多组双向方差分析
图10
图10
条件性Twist1消融小鼠UUO肾组织和巨噬细胞中galectin-3的表达降低。一代表性免疫染色（× 40）Galectin-3（绿色）和巨噬细胞（红色；F4/80）在3µm肾脏切片中的表达b条条形图分析显示，四组小鼠的巨噬细胞中galectin-3的表达与肾脏的显示一致。条形标尺=50微米。n个=每组3只动物，n个=每只小鼠分析3张显微照片，WT-UUO与KO-UUO。c（c）流式细胞术分析F4/80中galectin-3的表达+CD206型+UUO后14天从肾组织中取出。d日肾组织中纤维化肾巨噬细胞浸润的条形图分析Cre公司 + 扭转1fl/flUUO后14天，与野生型产仔UUO肾脏的巨噬细胞进行比较，n个=每组3只动物*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01. 数据表示为平均值 ± SEM。首先对数据进行正态分布分析，如果数据通过正态检验，则双尾Student’st吨对两组进行检验，对多组进行双向方差分析
图11
图11
Knockdown Twist1降低巨噬细胞中半乳糖凝集素-3的表达。一实时PCR分析暴露于IL-4、siRNA-Twist1和空载体对照的Twist1-沉默Raw264.7细胞中galectin-3的mRNA丰度，n个=3个独立实验。b条骨髓基质细胞中半乳糖凝集素-3 mRNA丰度的实时PCR分析Cre公司 + 扭转1fl/fl小鼠和野生型窝鼠galectin-3上调*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01. 数据表示为平均值 ± SEM。首先对数据进行正态分布分析，如果数据通过正态检验，则双尾Student’st吨采用两组测试和多组双向方差分析
图12
图12
半乳糖凝集素-3调节Twist1介导的M2巨噬细胞极化。一BMM中Arg-1、MR、IL-10和Fizz1的相对mRNA丰度Cre公司 + 扭转1fl/fl半乳糖凝集素-3上调小鼠，BMMs来自Cre公司 + 扭转1fl/flgalectin-3上调小鼠与Cre公司 + 扭转1fl/fl没有galectin-3上调的小鼠，n个=每组3只动物，n个=3个独立实验。b条Twist1-沉默和galectin-3-上调的Raw264.7细胞中Arg-1、MR、IL-10和Fizz1的相对mRNA丰度，galectin-3上调的siRNA-Twist1与galectin-30上调的siRNA-Twit1，n个=3个独立实验。中的数据一和b条被双尾学生的t吨测试*P（P） < 0.05**P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001. 数据表示为平均值 ± 扫描电镜
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参考文献

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