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.2022年2月15日；132（4）：e141848。
doi:10.1172/JCI141848。

与年龄相关的GSK3β过度表达导致足细胞衰老和肾小球老化

方玉东 1 2 三, 陈伯翰 1 4, 刘章锁 三, 雅典娜·Y·贡 1, 威廉·T·冈宁 5, 颜戈 1, 迪帕克·马哈拉 1, 阿米拉·F·戈哈拉 5, 兰斯·德沃金 1 2 4, 龚如军 1 2 4 6
附属公司

与年龄相关的GSK3β过度表达导致足细胞衰老和肾小球老化

方玉东等人。 临床研究杂志. .

摘要

随着预期寿命的持续增加，临床医生面临着与年龄相关的肾损害的挑战，包括足细胞衰老和肾小球硬化。现在有令人信服的证据表明，锂具有有效的抗衰老活性，可以改善果蝇和秀丽隐杆线虫的大脑老化并延长寿命。糖原合成酶激酶3β（GSK3β）是锂作用的主要分子靶点，也是一种最近与多种肾脏疾病有关的多任务蛋白激酶，随着年龄的增长，它在肾小球足细胞中过表达和过度活跃，与肾脏衰老的功能和组织学迹象有关。此外，足细胞特异性消融GSK3β可显著减轻小鼠足细胞衰老和肾小球老化。从机制上讲，衰老信号的关键介质，如p16INK4A和p53，包含大量GSK3β共有基序，与GSK3？发生物理相互作用，并充当其假定的底物。此外，在小鼠生命后期通过小剂量锂对GSK3β进行靶向治疗可降低衰老信号和延缓肾脏衰老。此外，在精神病患者中，碳酸锂治疗抑制了GSK3β活性，减轻了尿脱落足细胞的衰老信号，并与肾功能的保护有关。因此，GSK3β似乎通过调节衰老信号在足细胞衰老中发挥关键作用，可能是延缓肾脏衰老的一个可行的衰老靶点。

关键词：老化；双相情感障碍；细胞衰老；细胞骨架；肾脏学。

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数字

图1
图1。肾小球中GSK3β的表达随年龄增加而增加，主要定位于肾小球足细胞。
(A类)肾皮质转录组的事后分析是基于Rodwell衰老肾脏研究得出的Nephroseq数据集进行的，排除了血清肌酐水平或血压异常或其他共病的受试者。GSK3βmRNA表达水平，以log表示2以中位数为中心的强度，适用于45至60岁的受试者(n个=9） 与年轻受试者相比(n个=7).P（P）显示值。(B类)来自Ju-CKD-Glom数据集的肾小球转录组的基因集富集分析表明，专家管理的肾脏老化相关基因集RODWELL_aging_kidney_UP富含高GSK3β表达表型。标准化浓缩分数（NES）和标称值P（P）显示值。(C类)非肿瘤性肾切除标本取自不同年龄段的患者（年轻或Y，<30岁；中年或M，30-59岁；老年受试者或O，60-79岁），如补充图1所示。连续肾切片进行GSK3β和p16免疫组化染色墨迹4a，以及WT-1的免疫荧光染色。比例尺：20μm。(D类和E类)GSK3β与肾小球相对染色强度的线性回归分析(D类)第16页INK4A（墨水）或(E类)每个受试者每个肾小球横截面（gcs）WT-1阳性足细胞的数量(n个=每组6名受试者，每组分析60个肾小球，每组10个受试者）。IOD，集成光密度。(F类和G公司)线性回归分析表明，GSK3β的平均相对肾小球染色强度(F类)与全球肾小球硬化和(G公司)与估计肾小球滤过率（eGFR）呈负相关(n个=6). 斯皮尔曼相关系数(R（右）)和P（P）显示值。面板A类与双尾、未配对学生的t吨测试。面板D类——G公司采用线性回归进行统计学分析。
图2
图2。在小鼠衰老过程中，GSK3β在肾小球足细胞中过度表达和高活性，并与足细胞衰老、衰老相关分泌表型（SASP）和肾脏衰老相关。
(A类)按照补充图2所述对小鼠进行治疗。在2个月龄、12个月龄或24个月龄（mo）时连续采集肾脏切片，进行过氧化物酶免疫组化染色。如箭头所示，方框区域的放大视图显示足细胞染色阳性。比例尺：20μm和4μm（放大图像）。(B类)线性回归分析显示GSK3β和p16的相对肾小球染色强度之间存在显著相关性INK4A（墨水）通过计算机形态分析估计(n个=6只小鼠，每组分析60个肾小球，每组10个）。IOD，集成光密度。(C类和D类)线性回归分析显示GSK3β的平均相对肾小球染色强度与(C类)全球肾小球硬化或(D类)血清肌酐水平(n个=6). (E类)分离肾小球的代表性免疫印迹分析，用于指示蛋白质。GAPDH作为负载控制。(F类)线性回归分析显示相对p-GSK3β第9部分/GSK3β比值和p16的相对表达水平INK4A（墨水）基于免疫印迹密度分析的肾小球p53(n个=6). (G公司)肾组织进行荧光免疫组织化学染色。方框区域的放大视图显示WT-1中SASP因子阳性染色+足细胞。比例尺：30μm（左3列）和3μm（放大图像）。(H（H）)分离肾小球的代表性免疫印迹分析SASP因子。肾小球中各种SASP因子表达水平的密度分析，根据免疫印迹分析显示为归一化为β-微管蛋白的相对水平**P（P）<不同年龄组间0.01(n个=6). 数据表示为平均值±标准偏差。斯皮尔曼相关系数(R（右）)和P（P）值显示在面板中B类——D类和F类.面板H（H）采用单因素方差分析。
图3
图3。小鼠足细胞特异性GSK3β消融可缓解足细胞衰老和衰老相关分泌表型（SASP），并改善肾脏衰老。
(A类)示意图说明了动物实验设计。(B类)从足细胞特异性GSK3β-敲除（KO）和对照（Con）小鼠2个月龄（mo）的肾脏标本进行处理，以进行GSK3？的过氧化物酶染色，如代表性显微照片所示。箭头表示GSK3β阳性足细胞。比例尺：20μm。(C类)肾脏标本进行WT-1和podocin的荧光免疫染色，p16的过氧化物酶免疫染色INK4A（墨水）和SA-β-gal活性染色，如代表性显微照片所示。比例尺：20μm。(D类和E类)平均数量(D类)工作任务-1+足细胞和(E类)SA-β-半乳糖+绝对计数每肾小球横截面（gcs）的病灶数*P（P）< 0.05 (n个=每组6只小鼠）。(F类)在指定的时间点收集现场尿液，并用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色法分离等分（20μL）。牛血清白蛋白（BSA；1、2和4μg）作为标准对照。尿样经处理后用于白蛋白ELISA分析，并调整肌酐浓度*P（P）< 0.05 (n个=6). (G公司)KO小鼠的血清肌酐水平显著低于Con小鼠*P（P）<0.05 (n个=6). (H（H）)从Con和KO小鼠分离的肾小球的代表性免疫印迹分析显示的蛋白质。β-管蛋白用作负荷控制。(我)24个月时采集的肾脏标本进行SASP因子的荧光免疫组化染色。比例尺：50μm。(J型)24个月时分离的肾小球SASP因子的代表性免疫印迹分析。肾小球中SASP因子表达水平的密度分析，根据免疫印迹分析显示为归一化为β-微管蛋白的相对水平*P（P）<0.05, **P（P）<0.01 (n个=6). 数据表示为平均值±标准偏差。面板D类——G公司和J型由双尾、未配对学生的t吨测试。
图4
图4。KO小鼠原始足细胞的细胞衰老和衰老相关分泌表型（SASP）减轻，GSK3β重建后恢复。
(A类)从12个月龄对照小鼠（Con）和足细胞特异性GSK3β敲除小鼠（KO）的肾小球分离出初级足细胞。典型的显微照片显示了新分离的肾小球和足细胞的原代培养物。比例尺：75μm。(B类——E类)使用Amaxa Nucleofection试剂盒，使用空质粒载体（EV）或编码HA结合WT GSK3β的质粒对初级足细胞进行基于电穿孔的转染。(B类)对细胞进行SA-β-gal活性染色或免疫荧光染色，用于突触足蛋白（SYNPO；红色）或γH2AX（绿色），然后用DAPI对细胞核进行复染，或用罗丹明鬼笔素对F-肌动蛋白进行复染（红色）。比例尺：20μm（顶部2行）和30μm（底部一行）。(C类)对细胞裂解液进行免疫印迹分析，以检测指示蛋白，包括SASP因子，如纤维连接蛋白（FN）和PAI-1。β-管蛋白用作负荷控制。(D类)γH2AX数量的绝对计数+细胞表示为每个显微视野中细胞总数的百分比*P（P）与所有其他组相比<0.05(n个=3). (E类)SA-β-gal的定量+细胞占每个显微视野中细胞总数的百分比*P（P）与所有其他组相比<0.05(n个=3). 数据表示为平均值±标准偏差。面板D类和E类采用单因素方差分析和Tukey检验进行分析。
图5
图5。第16页INK4A（墨水）p53与肾小球足细胞中的GSK3β共同定位并相互作用，作为其假定底物。
(A类)用抗GSK3β抗体或免疫前IgG处理分化的永生化小鼠足细胞的裂解液和从WT小鼠分离的肾小球匀浆进行免疫沉淀（IP），然后进行免疫沉淀的免疫印迹分析（IB），以检测GSK3？，p16INK4A（墨水）和p53与输入控制并行。(B类和C类)GSK3β（红色）和p16的双色荧光免疫染色INK4A（墨水）（绿色）或p53（绿色）英寸(B类)荧光显微镜或(C类)激光扫描共聚焦荧光显微镜显示培养的小鼠足细胞。比例尺：20μm。(D类)电子分析显示p16中GSK3β磷酸化的假定一致模体中的丝氨酸/苏氨酸残基INK4A（墨水）和p53。GSK3β共有基序预测分数较高的丝氨酸和苏氨酸标记为绿色圆圈。
图6
图6。GSK3β调节p16的磷酸化INK4A（墨水）和p53，导致足细胞衰老信号的调节。
用对照空质粒载体（EV）或编码GSK3β的HA结合显性负性激酶死亡（KD）突变或GSK3？在有或无氯化锂（LiCl，10 mM）的情况下的组成活性（S9A）突变的质粒瞬时脂质转染条件性永生化小鼠足细胞或同等体积的车辆。(A类)不同处理后，细胞进行HA免疫荧光染色，显示出约80%的转染效率。比例尺：20μm。(B类)使用抗p16抗体处理全细胞裂解物进行免疫沉淀（IP）INK4A（墨水）或-p53抗体，然后进行免疫沉淀物磷酸化丝氨酸（p-Ser）免疫印迹分析（IB），并与输入对照平行。(C类)所示分子的细胞裂解物的代表性免疫印迹分析。β-管蛋白用作负荷控制。(D类)对细胞进行SA-β-gal活性染色，或对突触足蛋白（SYNPO；红色）或γH2AX（绿色）进行免疫荧光染色，然后用DAPI对细胞核进行复染，或用罗丹明鬼笔肽对F-肌动蛋白进行复染（红色）。比例尺：20μm。(E类)γH2AX数量的绝对计数+细胞占每个显微视野中细胞总数的百分比*P（P）<0.05与所有其他组(n个=3). (F类)SA-β-gal的定量+细胞占每个显微视野中细胞总数的百分比**P（P）<0.01与所有其他组比较(n个=3). 数据表示为平均值±标准偏差。面板E类和F类采用单因素方差分析和Tukey检验进行分析。
图7
图7。生命后期每周微剂量锂治疗可抑制小鼠足细胞衰老和衰老相关分泌表型（SASP），从而延缓肾脏衰老。
(A类)示意图说明了优化小鼠锂治疗方案的初步实验。(B类)在LiCl或NaCl治疗后的指定天数（d），从整个肾脏（每组3只动物）中提取蛋白质，以进行指定分子的免疫印迹分析。(C类)示意图说明了WT衰老小鼠的实验设计。(D类)在指定月份（mo）收集现场尿液，用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色法分离等分（20μL）。牛血清白蛋白（BSA；1、2和4μg）作为标准对照。尿样经处理后用于白蛋白ELISA分析，并调整肌酐浓度*对<0.05(n个=6). (E类)通过血清肌酐水平评估肾功能*P（P）<0.05 (n个=6). (F类)肾标本进行WT-1或SA-β-gal活性染色的免疫荧光染色。比例尺：20μm。(G公司)WT-1的平均数量+细胞和SA-β-gal+绝对计数每肾小球横截面（gcs）的病灶数*P（P）<0.05 (n个=每组6只小鼠）。(H（H）)分离肾小球的代表性免疫印迹分析。根据免疫印迹分析，以归一化为β-微管蛋白的相对水平表示指示蛋白质表达水平的密度分析**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001, ****P（P）<0.0001 (n个=6). (我)18个月时分离的肾小球SASP因子纤维连接蛋白（FN）、PAI-1和TGF-β1的代表性免疫印迹分析。根据免疫印迹分析，以归一化为β-微管蛋白的相对水平表示指示蛋白质表达水平的密度分析**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001 (n个=6). 数据表示为平均值±标准偏差。面板D类,E类，以及G公司——我由双尾、未配对学生的t吨测试。
图8
图8。精神病患者长期碳酸锂治疗可抑制GSK3β活性并减缓尿脱落细胞的细胞衰老。
(A类)示意图描述了用碳酸锂[Li（+），n个=12] 或不含碳酸锂[Li（–），n个=12]. 比例尺：100μm。(B类)荧光显微镜和差示干涉对比（DIC）显微镜显示，尿脱落细胞免疫荧光染色联会蛋白（红色），DAPI反染细胞核。箭头表示突触素阳性足细胞，而箭头表示突触素阴性尿细胞。比例尺：20μm。(C类)尿脱落细胞丝氨酸9磷酸化GSK3β的多色免疫荧光染色第9部分)，第16页INK4A（墨水）和WT-1。箭头表示具有p-GSK3β的WT-1阳性尿足细胞S9-lo系列第16页你好染色模式。箭头表示WT-1阳性尿足细胞和p-GSK3βS9-高第16页洛染色模式。比例尺：100μm。(D类)p16高表达和低表达细胞的定量INK4A（墨水）在所有WT-1中+尿细胞**P（P）<0.01 (n个=12). (E类)尿脱落细胞免疫荧光染色联会蛋白（SYNPO），然后用DAPI进行反染。比例尺：20μm。(F类)尿脱落细胞的γH2AX免疫荧光染色，然后用DAPI进行复染。比例尺：20μm。γH2AX阳性细胞数量的绝对计数，以每个显微镜视野下尿脱落细胞数量的百分比表示**P（P）<0.01 (n个=12). 数据表示为平均值±标准偏差。面板D类和F类由双尾、未配对学生的t吨测试。
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中的注释

  • GSK3β与衰老肾脏。
    克雷德伯格JA，舒马赫VA。 Kreidberg JA等人。 临床投资杂志。2022年2月15日；132（4）：e155885。doi:10.1172/JCI155885。 临床投资杂志。2022 PMID：35166232 免费PMC文章。
  • GSKβ作为足细胞衰老的靶点。
    Shankland SJ，Wessely O。 Shankland SJ等人。 《肾脏国际》2022年9月；102(3):463-465. doi:10.1016/j.kint.2022.04.041。Epub 2022年6月1日。 《肾脏国际》2022。 PMID：35660495 没有可用的摘要。

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