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.2022年12月；16(1):13-24.
doi:10.1080/19336918.2022.2029237。

TNF-α调节牙龈上皮细胞的基底膜成分和细胞基质粘附

马萨鲁·梅扎瓦 1 2, Yuto Tsuruya村 1, 山口阿里萨 1, 山崎瑞穗 1, 河野哲郎 2 三, 冈田裕久 2 三, 克里斯托弗·麦库洛赫 4, Yorimasa Ogata公司 1 2
附属公司

TNF-α调节牙龈上皮细胞的基底膜成分和细胞基质粘附

马萨鲁·梅扎瓦等。 细胞Adh迁移. 2022年12月.

摘要

层粘连蛋白5、4型胶原和α6β4整合素有助于牙周组织上皮中半桥粒的形成，这对牙龈连接的发育和维持至关重要。由于尚不清楚TNF-α是否会改变上皮细胞周围基质的组成，因此，人牙龈上皮细胞是在TNF-β存在或不存在的情况下培养的。TNF-α治疗加速了上皮细胞的迁移和体外伤口的闭合。这些数据出乎意料地表明，TNF-α促进上皮细胞周围细胞周基质的形成，并增强上皮细胞与底层基质的粘附，这些特性对细胞迁移和齿龈连接的完整性很重要。

关键词：肿瘤坏死因子-α；基膜；细胞粘附；细胞迁移；细胞外基质；牙龈上皮；层粘连蛋白5。

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数字

图1。
图1。
TNF-α调节细胞外基质的消化途径。（a） 再上皮化伤口愈合分析。在Radius™24孔板（纤连蛋白涂层）上分析Ca9-22细胞的再上皮化。胎面IL-1β和TNF-α分别于胎面6 h和24 h后进行荧光显微镜观察。采用三种不同的细胞染色法进行细胞核DAPI染色。（b） IL-1β和TNF-α处理的细胞的平均伤口愈合面积（再上皮化）如图所示。数据代表了三个实验的结果。IL-1β（1 ng/ml）和TNF-α（10 ng/ml。定量提取RNA前，对IL-1β和TNF-α处理6或24小时的Ca9-22细胞中（c）TNF-β、（d）MMP-2、（e）MMP-9和（f）TIMP-1的mRNA表达。数据是来自3个单独实验的平均SEM±。（g） Ca9-22细胞裂解产物的TAK1、MMP-9和TIMP1免疫印迹分析。β-actin作为负荷对照。这些数据代表了3个单独的实验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。（h） α6整合素中和抗体（GoH3）对细胞迁移的影响。使用TNF-α（10 ng/ml）和整合素中和抗体（10μg/ml）刺激的Ca9-22细胞进行24小时的迁移分析。显微镜观察显示，TNF-α处理的损伤细胞在抓挠后伤口迅速愈合。刮擦后面板立即显示细胞（左面板），24小时后显示细胞（右面板）。
图2。
图2。
TNF-α影响半桥粒的形成。IL-1β（1 ng/ml）和TNF-α（10 ng/ml。在提取RNA之前，对IL-1β和TNF-α处理6或24小时的Ca9-22细胞中（a）β4整合素和（b）Cadherin 1的mRNA表达进行定量。数据是来自3个单独实验的平均SEM±。（c） 在β4整合素、细胞角蛋白19和Rho-GEF蛋白的免疫印迹分析中，从Ca9-22细胞裂解物。β-actin作为负荷对照。这些数据代表了3个单独的实验。*p<0.05。（d~f）将胶原酶处理的Ca9-22细胞接种在纤连蛋白（10μg/mL）包被的培养皿上，并用TNF-α（10ng/mL）处理24小时。然后对其进行固定，并通过渗透性进行plectin免疫染色。使用抗β4整合素和抗整合素进行细胞间补体的免疫染色和共定位，并在蔡司LSM 510共焦显微镜下成像。每个标记和细胞类型至少测量30个细胞。比例尺：20μm。计算图像J皮尔逊系数以确定共定位。*p<0.05。
图3。
图3。
TNF-α对基膜成分有影响。IL-1β（1ng/ml）和TNF-α（10ng/ml）对Ca9-22细胞基底层组成分子mRNA和蛋白水平的影响。定量提取RNA前经IL-1β和TNF-α处理6 h或24 h的Ca9-22细胞中（a）层粘连蛋白β3、（b）层粘着蛋白γ2、（c）层粘连蛋白α3、（d）IV型α1胶原和（e）I型α1胶原蛋白的mRNA表达。数据是来自3个单独实验的平均SEM±。（f） 从Ca9-22细胞制备的裂解物中对层粘连蛋白5、层粘连素5受体、IV型胶原和I型胶原进行免疫印迹分析。β-actin作为负荷对照。这些数据代表了3个单独的实验。**p＜0.01，***p＜0.001。
图4。
图4。
TNF-α促进细胞内外层粘连蛋白5的合成。（a） 将胶原酶处理过的Ca9-22细胞涂布在纤维连接蛋白（10μg/mL）涂层培养皿上，并用TNF-α（10 ng/mL）处理24 h。然后对其进行固定，并通过渗透性或非渗透性对层粘连蛋白5进行免疫染色。（b和c）使用抗β4整合素和抗层粘连蛋白5进行共定位免疫染色，并用蔡司LSM 510共焦显微镜成像。每个标记和细胞类型至少测量30个细胞。比例尺：20μm。计算图像J皮尔逊系数以确定共定位。*p<0.05。
图5。
图5。
TNF-α抑制细胞内和细胞外Ⅳ型胶原的合成。（a） 将胶原酶处理过的Ca9-22细胞涂布在纤维连接蛋白（10μg/mL）涂层培养皿上，并用TNF-α（10 ng/mL）处理24 h。然后固定并免疫染色，以检测Ⅳ型胶原的渗透性或非渗透性。（b和c）使用抗β4整合素和抗Ⅳ型胶原进行免疫染色以进行共定位，并在蔡司LSM 510共焦显微镜下成像。每个标记和细胞类型至少测量30个细胞。比例尺：20μm。计算图像J皮尔逊系数以确定共定位。
图6。
图6。
TNF-α促进细胞外ODAM的合成。（a） 将胶原酶处理过的Ca9-22细胞涂布在纤维连接蛋白（10μg/mL）涂层培养皿上，并用TNF-α（10 ng/mL）处理24 h。然后在不渗透的情况下对其进行固定和ODAM免疫染色。（b和c）使用抗β4整合素和抗Ⅳ型胶原进行免疫染色以实现共定位，并使用蔡司LSM 510共焦显微镜进行成像。每个标记和细胞类型至少测量30个细胞。比例尺：20μm。计算图像J皮尔逊系数以确定共定位。*p<0.05。
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