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.2022年1月14日；7(1):6.
doi:10.1038/s41536-021-00197-1。

一种用于软组织重建的免疫活性脂肪衍生细胞外基质生物材料：临床试验概念

艾米·安德森 1, 吴爱文（Iwen Wu） 2, 亚历克西斯·J·帕里略 2, 马修·T·沃尔夫 2 三, 大卫·R·梅斯塔斯Jr 2, 教授和伊安·格林汉姆 2, 艾达·J·谭 4, 蕾切尔·M·佩恩 5, 杰弗里·阿斯顿 5, 卡里萨·库尼 5, 长拜恩 6, 达蒙·S·库尼 5, 詹妮弗·埃利塞夫 7
附属机构

一种用于软组织重建的免疫活性脂肪衍生细胞外基质生物材料：临床试验概念

艾米·安德森等。 NPJ Regen Med公司. .

摘要

软组织重建仍然是一个棘手的临床挑战，因为当前的手术选择和合成植入物可能产生不充分的结果。软组织缺损可以使用自体脂肪组织进行手术重建，但这些手术可能导致供体部位发病，需要多次手术，且结果差异很大。为了满足这一临床需求，我们从同种异体人体组织（脱细胞脂肪组织，AAT）中开发了一种“非现成”脂肪细胞外基质（ECM）生物材料。我们应用物理和化学处理方法去除脂质，并创建一种模拟吸脂剂特性的可注射基质。使用细胞迁移和脂肪生成分析评估生物活性。小鼠肌肉损伤模型再生免疫特性的表征表明，同种异体和异种AAT可诱导促再生CD4+带有异种移植物AAT的T细胞和巨噬细胞额外吸引分泌白细胞介素4（Il4）的嗜酸性粒细胞。在免疫功能受损的小鼠中，AAT注射保留了与人类脂肪移植物相似的体积，但在脂肪移植物中没有囊肿和钙化。AAT与人类脂肪源性干细胞（ASC）的结合导致植入物体积降低。然而，组织重塑和脂肪生成与ASC结合显著增加。较大注射量的猪源AAT在约克郡杂交猪中同种异体应用时表现出生物相容性和更大的保留力。AAT被植入健康志愿者的腹部组织中，随后通过选择性手术移除。所有人类受试者对AAT植入物耐受性良好。在1至18周内取出的植入物显示细胞浸润和免疫细胞数量增加，表明组织持续重塑，并有可能进行长期组织替换。

PubMed免责声明

利益冲突声明

J.H.E.持有Aegeria Soft Tissue的股权，该公司已授权JHU对本研究中使用的AAT材料拥有知识产权。约翰·霍普金斯政策协调办公室正在处理这场冲突。其余作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。一种脂肪衍生生物材料，脱细胞脂肪组织（AAT）保留了组织特异性，有利于体外化学吸引和脂肪生成。
一整体脂肪组织加工的宏观表现，以创建可注射的脂肪细胞外基质生物材料。b条尸体天然脂肪组织的大体图像。c（c）天然脂肪组织中中央脂滴（红色）的尼罗河红染色。d日天然脂肪组织中胶原细胞外基质（绿色为Col1，蓝色为DAPI）周围细胞的荧光染色。e（电子）脱细胞和脱脂处理中间体的大体图像。（f）使用油红O（红色）对细胞内脂质进行脱细胞和脱脂处理中间产物染色。克最终注射产品的大体图像。小时AAT的扫描电子显微镜。我AAT的Col1（绿色）荧光染色。j个AAT和匹配供体脂肪的总脂含量表明，加工过程中脂肪去除率>98%。k通过羟脯氨酸分析测定总胶原蛋白含量。我AAT诱导脂肪干细胞在6 跨孔分析中的h。米AAT接种ASCs后，Col1（绿色）和Actin（红色）荧光染色。n个尼罗河红染色法检测添加成脂介质的ASC AAT中的细胞内脂质（黄色）。o个通过LC-MS/MS分析AAT和ACD之间的共享和唯一蛋白质数量。第页通过LC-MS/MS对AAT和ACD中鉴定的肽进行分类。q个ACD和AAT培养的ASC三维结构。第页结构边缘和中心的油红O染色（红色）。秒第3天标准化为ACD的3D结构中脂肪生成标记物的差异基因表达。重要性(第页-值）：*<0.05, **<0.01, ***<0.001, ****<0.0001. 误差线表示±1标准偏差。比例尺代表100 微米。
图2
图2。AAT在无胸腺小鼠中显示出体积保持性和优越的生物相容性。
一植入无胸腺裸鼠时AAT与补充ASCs的AAT的体积持久性(n个 = 每组12个），原位12周后恢复种植体的大体图像。b条皮下注射人脂肪抽吸物（脂肪移植）和AAT在裸鼠体内的容量保持(n个 = 每组6个），使用数字卡尺进行经皮测量，原位12周后恢复种植体的大体图像。c–e类植入物的H&E染色在12周后恢复，用虚线表示植入物边界。c（c）含有ASC的AAT植入物内新脂肪组织形成（箭头）。d日AAT植入物内的脂肪生成和血管化（箭头所示）。e（电子）脂肪移植物内钙化（箭头）和囊肿形成（*）的迹象。误差线表示±1标准偏差。比例尺代表1 整段为mm，100 µm（放大区域）。
图3
图3。AAT通过招募表达Il4的免疫细胞，在不可逆体积性肌肉丧失（VML）手术创伤模型中引发促再生反应。
一术后立即将AAT支架或生理盐水直接应用于股四头肌双侧手术切除小鼠的伤口部位。1周后处死动物，通过流式细胞术评估生物材料的局部免疫反应。b条伤后1周，健康股四头肌和VML伤口用载剂（生理盐水）或AAT支架治疗的大体图像。c（c）4get小鼠实验中免疫人群的流式细胞术门控（补充图2中的完全门控）。d日从未受伤（健康）的对照股四头肌和肌肉伤口中分离的免疫细胞群，这些肌肉伤口用生理盐水或同种（小鼠AAT，mAAT）或异种（人类AAT，hAAT）ECM支架治疗。e（电子）Il4表达（以嗜酸性粒细胞百分比和中值荧光强度（MFI）表示）（f）CD4细胞+从4get小鼠伤口分离出的T细胞。显示了各组之间的显著性(第页-值）：*<0.05, **<0.01, ***<0.001, ****<0.0001. 误差线表示±1标准偏差。
图4
图4。AAT支架使肌肉创伤中的巨噬细胞偏向M2型。
一巨噬细胞中CD206和CD86的表达（CD45+SiglecF公司-CD11b型+CD3（CD3）-赖氨酸6克−赖氨酸6c−80层/四层+)术后1周，从健康股四头肌和支架或盐水处理的肌肉伤口中分离。b条交替激活的“M2”（CD206+CD86型−)，经典激活的“M1”（CD206−CD86型+)，双极化（CD206+CD86型+)和非极化的（CD206−CD86型−)用流式细胞术定量巨噬细胞。c（c）规范M2的表达式(Il4号机组,精氨酸1)和M1(Ifng公司,2个)通过qRT-PCR检测伤口部位的基因。描述了与车辆控制相关的重要性(第页-值），其他重要值见补充表2：*<0.05, **<0.01, ***<0.001, ****<0.0001. 误差线表示±1标准偏差。
图5
图5。异体AAT在大批量使用时是安全且持久的。
一在约克郡杂交猪皮下注射猪脂肪衍生ECM植入物，在注射后和原位1个月后立即成像。b条猪源脂肪ECM原位1个月后的大体图像和H&E染色；边缘和中心的高倍图像显示细胞浸润，包括嗜酸性粒细胞（箭头所示）。c（c）原位注射1个月后的体积保持率。d日通过初始注射体积确定的猪植入物边缘和中心之间的细胞计数比率。误差线表示±1标准偏差。比例尺代表5 整段为mm，100 µm（放大区域）。
图6
图6。健康志愿者皮下注射AAT。
一在第一次人体第一阶段研究中，在早期、中期和晚期从健康志愿者身上切除的AAT植入物的H&E染色。高倍插图显示细胞从邻近宿主组织迁移到AAT基质。b条多光谱免疫组织化学（IHC）显示血管的形成（CD31+)脂肪干细胞（CD34）的迁移+).c（c）CD4细胞+和CD8+多光谱IHC检测T细胞浸润。d日对6名受试者切除的AAT植入物进行流式细胞术分析，以量化免疫细胞（CD45+)在AAT植入物内招募，相对于从注射部位远端采集的多个受试者匹配脂肪组织样本。将每个修复的AAT植入物的结果归一化为多个匹配脂肪组织样本的平均值。所有受试者的数据汇总显示。e（电子）包括粒细胞（CD45）在内的不同免疫细胞亚群的相对丰度+CD11b型+CD15型+)，巨噬细胞（CD45+CD15型−CD11c公司+MHCII公司+CD11b型+CD14号机组+CD68型+)和T细胞（CD45+CD3（CD3）+). 所有受试者的数据汇总显示。（f）细胞内FoxP3和T的相对表达H（H）1，吨H（H）2和TH（H）从AAT和匹配脂肪组织中分离出的T细胞中的17种细胞因子在所有受试者中集中。克巨噬细胞极化标记物（CD163和CD80）在AAT和匹配脂肪组织中的表达。(小时)M1（CD80）的平均分布+CD163型−)，M2（CD163+CD80型−)AAT和匹配脂肪组织中双阳性和非极化巨噬细胞作为总巨噬细胞的频率。我MFI对所有受试者巨噬细胞极化（CD163，CD80）和谱系标记（CD11b，CD14）的表达进行汇总。重要性(第页-值）：*<0.05, **<0.01, ***<0.001, ****<0.0001. 中位数和四分位数显示在小提琴曲线图中。比例尺代表5 整段为mm，200 µm（放大区域）。
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