E-Cadherin-Deficient Epithelial Cells Are Sensitive to HDAC Inhibitors

doi:10.3390/cancers14010175

.2021年12月30日；14(1):175.

doi:10.3390/cancers14010175。

E-钙粘蛋白缺乏的上皮细胞对HDAC抑制剂敏感

利维安·德库蒂（Lyvianne Decourtye-Espiard）¹, 尼古拉·布根·齐科夫¹, 塔尼斯·戈德温¹, 汤姆·布鲁¹, 艾米莉·舒尔本¹, 迈克尔·A·布莱克¹, 帕里·吉尔福德¹

附属公司

PMID： 35008338
预防性维修识别码：项目管理委员会8749989
内政部： 10.3390/癌症14010175

E-钙粘蛋白缺乏上皮细胞对HDAC抑制剂敏感

利维安·德库蒂（Lyvianne Decourtye-Espiard）等。癌症（巴塞尔）. 2021.

.2021年12月30日；14(1):175.

doi:10.3390/cancers14010175。

作者

附属

¹新西兰达尼丁9016奥塔哥大学生物化学系转化癌症研究中心癌症遗传学实验室。

PMID： 35008338
预防性维修识别码：项目管理委员会8749989
内政部： 10.3390/癌症14010175

摘要

失活生殖系突变CDH1型基因（编码E-cadherin蛋白）是遗传性弥漫性胃癌（HDGC）和体细胞癌的遗传标志CDH1型突变是散发性弥漫性胃癌（DGC）和小叶性乳腺癌（LBC）发生的早期事件。在本研究中，测试组蛋白脱乙酰酶（HDAC）抑制剂优先抑制人类细胞系（MCF10A和NCI-N87）和缺乏有机物的小鼠的生长能力CDH1型表达式。CDH1型^-/-与野生型细胞相比，乳腺和胃细胞对泛HDAC抑制剂恩替诺司他、普契诺司他、莫西他司他和伏立诺司他更敏感，生长抑制作用增强，部分原因是细胞凋亡增加。CDH1型-空白细胞也对更多类别特异性HDAC抑制剂敏感，但与泛抑制剂相比，这些效应对遗传背景的影响较小。在两种情况下的胃类器官中也观察到对阿替宁的敏感性增加加拿大存托凭证1和Tp53型删除。然而，删除Tp53型基本上消除了加拿大存托凭证1-使类有机物对抑癌剂和莫西替诺司他无效。最后，entinostat增强了加拿大存托凭证1杂合子中的表达加拿大存托凭证1^+/-小鼠类有机物。总之，阿替尼司他是一种很有希望的药物，用于HDGC的化学预防和/或治疗，也可能有利于治疗散发性CDH1型-缺乏癌症。

关键词：CDH1；E-钙粘蛋白；HDAC抑制剂；HDGC；合成致命性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
TCGA和STAD数据库强调了HDAC与*CDH1型*表达式。HDAC类与*CDH1型*分析来自癌症基因组图谱（TCGA）和胃腺癌（STAD）数据库的表达，并计算每个HDAC和*CDH1型*（具体数值见表S4）。低表达用蓝色表示，高表达用红色表示(A类)锌和NAD+依赖性HDAC的层次聚类。HDAC与*CDH1型*的(B类)I类HDAC（HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8）(C类)IIa类HDAC（HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9）(D类)IIb类（HDAC6和HDAC10）(E类)III级HDAC（Sirtuins）和(F类)IV级HDAC（HDAC11）。HDAC与*CDH1型*表达式标有星号（*）。LC=Lauren分类，代表不同的胃癌亚型：红色、弥漫型；绿色，肠道；蓝色和混合亚型。

图2
Pan-HDAC抑制剂对缺乏E-cadherin的胃癌细胞具有合成致死作用-*CDH1型^−/−*48h后测定细胞核计数(A类)Entinostat诱导了0.63μM的合成致死效应，两组在2.5μM时的最大差异为36%。(B类)从0.31μM开始，镇静剂的效果显著，最大差异为29%。(C类)Mocetinostat在0.31μM时显著，最大差异为38%。(D类)Vorinostat诱导的合成致死效应为0.63～10μM，最大效应为2.5μM，两组差异为23%；n个=每种化合物3–5。所有IC50汇总在表S5中。具有统计意义的结果标记为*第页< 0.05, **第页<0.01和***第页< 0.001.

图3
Pan-HDAC抑制剂优先诱导胃E-cadherin缺乏细胞的凋亡和增殖。在NCI-N87中分析细胞凋亡、增殖和细胞周期-*CDH1型^−/−*用pan-HDAC抑制剂给药48小时后，NCI-N87-WT细胞。(A类)采用Annexin-V-FITC/碘化丙啶染色，流式细胞术分析细胞凋亡。Annexin-V-FITC标记早期凋亡细胞表达的膜蛋白，碘化丙啶染色核DNA仅在失去膜通透性的凋亡细胞（晚期凋亡，n个= 4–8). (B类)NCI-N87中的总凋亡百分比（早期和晚期凋亡的总和）增加-*CDH1型^−/−*与NCI-N87-WT细胞相比，使用2.5μM抑癌剂、0.3μM抑瘤剂和2.5μM伏立诺药物(n个=每种化合物3–5）。(C类)NCI-N87中的总增殖-*CDH1型^−/−*用pan-HDAC抑制剂给药48小时后，用流式细胞仪分析NCI-N87-WT细胞。与各自的DMSO相比，每种药物KI-67阳性细胞的差异被归一化。莫西替诺司他（0.6μM）和伏里诺司他（2.5μM）优先显著降低NCI-N87的增殖-*CDH1型^−/−*单元格与WT单元格的比较(n个= 4–7); * =第页-值<0.05CDH1型^−/−与WT和≠0相比，其值与各自的DMSO存在统计差异（值为0%）。(D类)通过流式细胞术，使用碘化丙啶染色，将细胞周期每个阶段的细胞百分比与各自的DMSO进行比较(n个= 4–5). Praconostat和vorinostat显著降低了NCI-N87的百分比-*CDH1型^−/−*G1期细胞，合理增加S期细胞比例。

图4
*加拿大存托凭证1*和*Tp53型*失活破坏胃器官形态。使用可诱导的Cre-lox小鼠产生有机物。WT类有机物在Cre诱导后表达可诱导的td番茄荧光。*加拿大存托凭证1^−/−*类有机物表现出td番茄表达和*加拿大存托凭证1*删除，同时*Cdh1型^−/−*/*Tp53型^−/−*类有机物显示tdTomato表达与*加拿大存托凭证1*和*Tp53型*用内毒素诱导缺失。种子接种后第1天诱导有机物，然后在第6天进行Western blot和免疫荧光。(A类)对从WT中提取的蛋白质进行Western blot，*加拿大存托凭证1^−/−*和*加拿大存托凭证1^−/−*/*Tp53型^−/−*类有机物。在110 kDa、53 kDa和45 kDa时观察到E-钙粘蛋白染色。(B类)在内洛昔芬诱导5天后，评估明亮视野和td番茄的表达。WT类有机物保持圆形形态，而两者*加拿大存托凭证1^−/−*和*加拿大存托凭证1^−/−*/*Tp53型^−/−*随着外翻的出现，类有机物表现出失去圆形性。(C类)WT上的免疫荧光，*加拿大存托凭证1^−/−*和*加拿大存托凭证1^−/−*/*Tp53型^−/−*含E-cadherin的类器官染色为绿色，td番茄染色为红色，DAPI染色为蓝色。两组患者均证实无E-cadherinCdh1型^−/−和*加拿大存托凭证1^−/−*/*Tp53型^−/−*类有机物。(D类)绿色Tp53免疫荧光染色。Tp53存在于WT和*加拿大存托凭证1^−/−*类有机物，在*Cdh1型^−/−*/*Tp53型^−/−*类有机物。(E类)接种后第6天进行KI-67标记增殖。在第6天，WT类有机物中没有KI-67（绿色），表明增殖停止，而*加拿大存托凭证1^−/−*和*加拿大存托凭证1^−/−*/*Tp53型^−/−*类有机物仍呈细胞增殖状态。(F类)在整个WT上每隔10微米测量KI-67和DAPI染色的强度比，*加拿大存托凭证1^−/−*和*加拿大存托凭证1^−/−*/*Tp53型^−/−*共焦显微镜下的类有机物。具有统计意义的结果标记为*第页<0.05和***第页< 0.001.

图5
E-cadherin缺乏的胃类有机物对pan-HDAC抑制剂更敏感。重量，*加拿大存托凭证1^−/−*和*加拿大存托凭证1^−/−*/*Tp53型^−/−*用不同的pan-HDAC抑制剂给类有机物下药48小时，然后测量类有机物的面积，并将其归一化为各自的载体对照。RFP荧光用于检测td番茄，并使用Cytation 5成像仪（Biotek，Winooski，VT，USA）测定类有机物的面积。(A类)Entinostat诱导了合成致死效应，WT类有机物和*加拿大存托凭证1^−/−*一个，40%用于*加拿大存托凭证1^−/−*/*Tp53型^−/−*类有机物。(B类)镇静剂对*加拿大存托凭证1^−/−*以及*加拿大存托凭证1^−/−*/*Tp53型^−/−*分别是有机物。(C类)莫西替诺司他优先靶向E-钙粘蛋白缺乏细胞，最多减少39%*Cdh1型^−/−*面积与WT面积相比，对*加拿大存托凭证1^−/−*/*Tp53型^−/−*类有机物。(D类)Vorinostat在WT和E-cadherin缺乏的胃类有机物之间未表现出任何显著的合成致死作用。n个=每种化合物3–5。表S5总结了所有IC50。具有统计意义的结果标记为*第页< 0.05, **第页<0.01和***第页< 0.001. (E类)WT的图片表示，*加拿大存托凭证1^−/−*和*加拿大存托凭证1^−/−*/*Trp53基因^−/−*7.5μM静注剂、0.25μM抑癌剂、0.63μM莫西替诺片和0.63μM伏立诺片后的类有机物。

图6
E-cadherin缺乏的乳腺类有机物对pan-HDAC抑制剂更敏感。WT和*加拿大存托凭证1^−/−*乳腺类器官由与胃类器官相同的Cre-lox小鼠产生，并用泛HDAC抑制剂给药。用药48小时后评估乳腺类器官面积，并将其归一化为各自的二甲基亚砜。(A类)Entinostat诱导了一种合成致死效应，在15µM时，WT和*加拿大存托凭证1^−/−*类有机物。(B类)镇静剂减少*加拿大存托凭证1^−/−*与WT相比，0.25µM时的增长率高达35%(C类)莫西替诺诱导SL效应，在10µM时，SL效应最大降低24%*加拿大存托凭证1^−/−*与WT乳腺类器官相比的面积。(D类)Vorinostat在最低浓度下表现出SL效应，与*加拿大存托凭证1^−/−*和WT类有机物；n个=每种化合物3–5。表S5总结了所有IC50。具有统计意义的结果标记为*第页<0.05和**第页< 0.01.

图7
Entinostat增加E-cadherin的表达*加拿大存托凭证1^+/−*类有机物，形成圆形形态。*加拿大存托凭证1^+/−*在第1天诱导类有机物，然后在第2天用entinostat或DMSO给药48小时(A类)在WT的第4天评估亮田和tdTomato的表达，*加拿大存托凭证1^+/−*和*加拿大存托凭证1^−/−*类有机物。*加拿大存托凭证1*表达减少与圆形性丢失和外翻有关。(B类)对*加拿大存托凭证1^+/−*用tentinostat或其各自的DMSO浓度处理48小时后的类有机物。芒果田和tdTomato在使用antinostat处理后保持了圆形形态。免疫荧光开启*Cdh1型^+/−*用E-cadherin绿色染色、td番茄红色染色和DAPI蓝色染色进行类器官染色。在诱导后观察到E-钙粘蛋白减少*加拿大存托凭证1^+/−*DMSO处理的类有机物，而tentostat处理的*加拿大存托凭证1^+/−*类器官维持了E-cadherin的强表达。(C类)循环*加拿大存托凭证1^+/−*在二甲基亚砜（DMSO）或抑肽酶（entinostat）给药后测量类有机物，值为1表示一个完美的圆圈(n个=43–97个分析的类有机物）。(D类)用流式细胞术检测服用阿替尼司他后E-cadherin的表达，以检测WT和*加拿大存托凭证1^+/−*胃类有机物并归一化为各自的二甲基亚砜(n个= 4). Entinostat治疗增加了E-cadherin在*加拿大存托凭证1^+/−*类有机物。具有统计意义的结果标记为*第页<0.05和***第页< 0.001.

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