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.2022年2月；237(2):1471-1485.
doi:10.1002/jcp.30606。 Epub 2021年10月26日。

STING介导的炎症对高狂饮乙醇喂养模型的影响

王玲（Ling Wang） 1, 洪美友 1, 洪武梦 1, 薛银盘 1, Xin Chen（新晨） 1, 一辉碧 1, 张亚飞 1, 李娟娟 1, Na-Na阴 1, 张正伟 2, 程晃 1, 李军（Jun Li） 1
附属公司

STING介导的炎症对高狂饮乙醇喂养模型的影响

王玲（Ling Wang）等。 J细胞生理学. 2022年2月.

摘要

酒精代谢导致肝细胞释放损伤相关分子模式（DAMP）。这包括线粒体DNA（mtDNA），线粒体DNA由受损的肝细胞生成并释放，通过产生促炎细胞因子而导致肝脏损伤。STING是DAMP的模式识别受体，已知其在各种病理过程中控制先天免疫的诱导。然而，对STING在Gao binge乙醇模型中的表达谱和功能仍知之甚少。我们证明，STING在Gao binge乙醇模型中上调。STING在肝脏Kupffer细胞中起mtDNA传感器的作用，在Gao-binge乙醇模型中诱导STING通路依赖性炎症，并进一步加剧肝细胞凋亡。这项研究为预测疾病进展和开发酒精性肝损伤的靶向治疗提供了新的见解。

关键词：高宾格乙醇模型；STING；细胞凋亡；炎症；线粒体DNA。

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数字

图1
图1
高宾格乙醇模型中肝细胞凋亡导致线粒体DNA释放。将WT小鼠暴露于液体（EtOH）或CD中16天，以诱导Gao binge乙醇模型。采用TUNEL分析（a）和流式细胞术（b）评估肝细胞凋亡。比例尺=50μm。线粒体依赖性凋亡标志蛋白（Bax、Bak、caspase 3和裂解caspase 2蛋白）的表达（c）。从EtOH喂养和CD喂养小鼠的血清中分离出总DNA，然后通过RT-qPCR（d）测量mtDNA水平。使用或不使用200μM EtOH培养AML12 24小时（Sun等人，2018）。离心细胞，通过实时PCR（e）测定上清液中的mtDNA水平。数据代表平均值±SEM*第页 < 0.05，***p<0.001，如图所示。对于所有面板，数据代表三个独立实验的平均值±SEM
图2
图2
体内外STING表达上调。小鼠肝组织中STING的蛋白（a）和mRNA（b）水平。从C57BL/6J小鼠中分离出原代KCs和原代肝细胞。KCs（c，d）和肝细胞（e，f）中STING的蛋白和mRNA表达。RAW264.7细胞在含有或不含mtDNA（200 ng/ml）的情况下培养24小时。RAW264.7细胞中STING的蛋白和mRNA表达（g，h）。图表显示TNF‐α、IL‐6和IL‐1β的mRNA（i）和蛋白质（j）表达。显示了具有代表性的图片。数据表示平均值±SEM*第页 < 0.05, **第页 < 0.01***第页<0.001，如图所示。对于所有面板，数据表示三个独立实验的平均值±SEM。KC、Kupffer细胞；mRNA、信使RNA；ns，不显著
图3
图3
STING缺乏可减轻高必格乙醇模型的炎症和肝损伤。荧光显微镜（a）和western blot分析（b）显示rAAV‐STING‐GFP在小鼠肝脏和初级KC中的有效转导。使用H&E、油红和TUNEL染色进行病理观察。比例尺：100、100、50μm（c、d）。图表显示了血清中AST（e）、ALT（f）和TG（g）的水平。图表显示了初级KCs（h）中TNF‐α、IL‐6和IL‐1βmRNA的表达以及血清（i）中TNF-α、IL-6和IL-1β的循环水平。Bax、Bcl2、caspase3和裂解caspase2（j）的蛋白质水平。n个 = 每组6人。数值显示为平均值±标准差**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001与rAAV8‐空处理车辆组相比，# 第页 < 0.05,## 第页 < 0.01,### 第页 < 与rAAV8空处理的EtOH喂养组相比，为0.001。对于所有面板，数据代表三个独立实验的平均值±SEM。丙氨酸氨基转移酶；天冬氨酸转氨酶；H&E、苏木精和曙红；KC、Kupffer细胞；mRNA，信使RNA
图4
图4
DMXAA诱导小鼠肝细胞凋亡和炎症。用DMXAA治疗WT小鼠16天。图表显示了体重（a）。肝组织切片的代表性H&E、油红染色和Tunel染色（b、c）。比例尺：100、100和50μm。血清AST、ALT和TG水平（d–f）。通过ELISA测定血清中促炎细胞因子（包括TNF‐α、IL‐1β和IL‐6）的循环水平（g）。RT-qPCR检测原代KCs（h）中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA水平。Bax、Bcl2、胱天蛋白酶3和裂解胱天蛋白酶3的蛋白质水平（i）。n个 = 每组6人。数值显示为平均值±SEM*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页 < 与CD喂养组相比为0.001，& 第页 < 0.05,&& 第页 < 0.01,&&& 第页 < 与CD喂养组相比为0.001。# 第页 < 0.05,## 第页 < 0.01,### 第页 < 与CD喂养组相比为0.001。对于所有面板，数据表示三个独立实验的平均值±SEM。丙氨酸氨基转移酶；天冬氨酸转氨酶；DMXAA，；酶联免疫吸附试验；H&E、苏木精和曙红；KC、Kupffer细胞；mRNA，信使RNA
图5
图5
STING过度表达和敲除对RAW264.7细胞炎症反应的影响。用或不使用DMXAA（100μg/ml）刺激RAW264.7细胞24小时。在DMXAA治疗24小时后收集细胞裂解物和培养上清液，以评估促炎细胞因子（IL‐1β、IL‐6和TNF‐α）的水平。通过RT-qPCR检测RAW264.7细胞（a）中促炎细胞因子的mRNA水平，并通过ELISA检测培养上清液（b）中促炎症细胞因子的分泌。用pEGFP-STING转染RAW264.7细胞并用mtDNA（100 ng/ml）处理。通过ELISA（c）和实时PCR（d）检测IL‐1β、IL‐6和TNF‐α的水平。用STING‐siRNA转染RAW264.7细胞并用mtDNA处理。通过ELISA（e）和实时PCR（f）测定蛋白质和mRNA水平*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001与对照组相比，## 第页 < 0.01,### 第页 < 0.001与pEGFP‐对照组相比，& 第页 < 0.05,&& 第页 < 0.01,&&& 第页 < 0.001与Scramble‐siRNA组相比。对于所有面板，数据表示三个独立体外实验的平均值±SEM
图6
图6
巨噬细胞因子调节肝细胞凋亡反应。CM从mtDNA处理的RAW264.7细胞和对照处理的RAW 264.7电池中收集。CM以1:1的比例与新鲜培养基混合，并补充AML12细胞48 h。使用western blot分析（a）检测凋亡相关蛋白水平。通过流式细胞术（b）和TUNEL染色（c）检测细胞凋亡*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001与对照治疗组相比。对于所有面板，数据表示三个独立体外实验的平均值±SEM
图7
图7
在Gao binge乙醇模型和RAW264.7细胞中mtDNA介导的STING‐TBK1‐IRF3/NF‐κB信号激活。通过western blot分析（a）测定CD喂养和EtOH喂养小鼠中STING、TBK1、磷酸化TBK1（p-TBK1）、磷酸化IRF3（p-IRF3）、NF-κBp65磷酸化（p-NFκBp 65）、NFκ）Bp65和β-actin的表达。用100 ng/ml的mtDNA刺激RAW264.7细胞1或3小时，并通过STING、IRF3、p‐IRF3、TBK1、p‐TBK1、NF-κBp65和p‐NF-κBp65的免疫印迹测定信号反应，β肌动蛋白作为负载对照（b）。用pEGFP‐STING质粒或STING‐RNAi转染活化的RAW264.7细胞24小时后提取蛋白质。通过western blot分析（c，d）测定STING、TBK1、磷酸化TBK1（p-TBK1）、磷酸化IRF3（p-IRF3）、磷酸化核因子κBp65（p-NFκBp 65）、核因子κ的Bp 65和β肌动蛋白的蛋白水平*第页 < 0.05, **第页 < 与CD喂养组相比为0.01，& 第页 < 0.05,&& 第页 < 与对照组相比为0.01，## 第页 < 与对照组相比0.01，@ 第页 < 0.05,@@ 第页 < 与pEGFP‐对照组相比为0.01，$ 第页 < 0.05,$$ 第页 < 与Scramble-siRNA组相比为0.01。对于所有面板，数据代表三个独立实验的平均值±SEM
图8
图8
肝mtDNA‐STING促进高宾格乙醇模型中的炎症和肝细胞凋亡。接受凋亡的肝细胞释放的mtDNA激活巨噬细胞，巨噬细胞通过调节STING‐TBK1‐IRF3/NF‐κB通路诱导IL‐1β、TNF‐α和IL‐6的表达，从而进一步加重肝损伤。线粒体DNA
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引用人

  • 酒精相关肝病。
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  • cGAS-STING信号轴在肝脏疾病中的双重功能。
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工具书类

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