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.2022年2月22日；50(3):1201-1220.
doi:10.1093/nar/gkab896。

腺病毒通过促进病毒RNA的高效剪接防止dsRNA的形成

亚历山大·M·普莱斯 1, 罗伯特·斯坦博克 1 2, 朝代 三, 凯萨琳娜·海耶 三, 李一泽 4, 克里斯汀·赫尔曼 1 2, 尼古拉斯A父母 4, 吉利安·N·惠兰 4, 苏珊·R·维斯 4, 马修·德·魏茨曼 1 5
附属机构

腺病毒通过促进病毒RNA的高效剪接防止dsRNA的形成

亚历山大·M·普莱斯等。 核酸研究. .

摘要

真核细胞通过模式识别受体（包括异常核酸结构的传感器）识别细胞内病原体。已知双链RNA（dsRNA）传感器可以检测RNA病毒的复制中间产物。长期以来，有人认为，DNA病毒基因组顶链和底链对称转录的mRNA退火可以在感染期间产生dsRNA。支持这一假设的是，几乎所有DNA病毒都编码dsRNA-再认识途径的抑制剂。然而，缺乏DNA病毒产生dsRNA的直接证据。与教条相反，我们证明了核复制DNA病毒腺病毒（AdV）在感染期间不会产生可检测到的dsRNA水平。相反，在感染有缺陷病毒RNA处理的AdV突变体的细胞核内检测到大量dsRNA。在存在核dsRNA的情况下，细胞质dsRNA传感器PKR在细胞核内重新定位并激活。病毒dsRNA的积累发生在感染的晚期，此时未切割的病毒转录物在顶链转录物和底链转录物之间形成内含子/外显子碱基对。我们认为，DNA病毒通过促进有效的剪接和mRNA处理来积极限制dsRNA的形成，从而避免了宿主先天免疫传感器对致病性核酸的检测和限制。

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图形摘要
图形摘要
重叠病毒转录物的高效剪接可能导致分子间dsRNA的形成。在野生型病毒感染期间，E1B55K/E4orf6病毒劫持泛素连接酶的存在导致细胞RNA结合蛋白（RBPs）RALY和hnRNPC的泛素化，从而阻止它们与病毒RNA的结合，导致病毒RNA的外显子区域与来自相反链的转录物的内含子区域之间形成dsRNA。在这些dsRNA分子形成后，一部分细胞质dsRNA-sensor PKR转位到细胞核，在那里它与病毒dsRNA共同定位，并被自身磷酸化激活。
图1。
图1。
仅在感染突变病毒时检测dsRNA。（A）)显示主要启动子、方向性和主要转录单位链的AdV转录组示意图。外显子显示为黑色，内含子显示为灰色虚线，多聚腺苷化位点显示为箭头。可能形成dsRNA的潜在区域反式通过poly（A）读通（粉红色）或内含子/外显子碱基布线（绿色）突出显示。(B类)单克隆抗体J2可以检测到dsRNA。用500 ng/mL聚肌苷：胞嘧啶转染A549s后，可以检测到dsRNA在细胞质中积累。(C)dsRNA用J2（绿色）染色，并用病毒复制中心（VRC）标记物DBP（品红色）共染色。细胞核用DAPI染色，核周边用虚线勾勒。在感染后24或48小时内，用WT Ad5或缺乏VA RNA的Ad5突变体（ΔVA，dl720）或整个E4区（ΔE4，dl1004）感染A549细胞。(D类)A549细胞在固定和渗透前用ΔE4感染38h。细胞在37℃下用单链RNase（RNase I）或双链RNA ase（RNA ase III）处理30分钟，然后用dsRNA（9D5，绿色）或VRC标记物DBP（品红色）染色。(电子)用WT或ΔE4病毒感染A549细胞48小时，感染倍数（MOI）如下，并用IFA染色dsRNA，如（C）所示。核dsRNA定量为平均核荧光强度（MNFI），每个细胞显示为一个点。dsRNA阳性阈值被定义为未感染细胞中dsRNA的MNFI的4个标准偏差，并显示为虚线。阈值以下的细胞为灰色，而核dsRNA阳性的细胞为黑色，这些阳性细胞的平均值和标准偏差用红色误差条表示。在感染每种病毒期间，表达dsRNA的细胞总数的百分比显示在x轴上它们的名称下方。统计显著性来源于未配对的双尾Mann–Whitneyt吨-测试，其中n.s.表示不重要。对于所有IFA，比例尺（白线）显示10μm。
图2。
图2。
dsRNA的形成与进入感染晚期相关。(A类)从三个独立的生物复制品中表达核dsRNA的受感染细胞的百分比被绘制为感染后小时的函数。阳性率定义为未感染条件下细胞的MNFI的4个标准偏差。条形图表示平均值，误差条形图表示标准偏差。分析的细胞总数从114个到203个不等，每种情况下平均176个细胞。显著性由非配对双尾确定t吨-测试，其中*表示P（P）-值<0.05。(B类)用WT或ΔE4 Ad5感染A549细胞32 h，并联合染色dsRNA（绿色）和病毒晚期蛋白pVII（品红色）。比例尺（白线）显示10μm。(C)（B）所示实验中病毒早期抗原（DBP+，灰色）或病毒晚期抗原（pVII+，黑色）阳性细胞的定量。(D类)来自（B）的ΔE4感染细胞的散点图突出了dsRNA和pVII的表达。虽然只有～50%的感染细胞显示dsRNA，但100%的晚期蛋白表达细胞显示dsRNA.dsRNA和pVII的阳性阈值被定义为高于未感染细胞MNFI的4个标准偏差。
图3。
图3。
病毒泛素连接酶活性阻止dsRNA的形成。(A类)dsRNA用J2（绿色）染色，并与以DBP（洋红色）标记的VRC共同染色。在MOI为10时，用WT Ad5或缺乏E1B55K（ΔE1B55K，dl110）、E4orf6（ΔE4orf 6，dl355*）或整个E4区域（ΔE 4，dl1004）的Ad5突变体模拟感染或感染A549细胞38小时(B类)来自（A）的核dsRNA被量化为MNFI，每个细胞显示为一个点。dsRNA阳性阈值被定义为未感染细胞中dsRNA的MNFI的4个标准偏差，并显示为虚线。阈值以下的细胞为灰色，而核dsRNA阳性的细胞为黑色，这些阳性细胞的平均值和标准偏差用红色误差条表示。在感染每种病毒期间表达dsRNA的总细胞的百分比显示在x轴上它们的名称下方。(C)以10的MOI感染补充AdV泛素连接酶各个方面的细胞32小时，如（A）中检测dsRNA并如（B）中定量dsRNA。Vero细胞不补充AdV基因，因此在感染ΔE1B55K（ΔE1B）和ΔE4突变病毒时检测到dsRNA。Vero-W162包含受内源性E4启动子控制的完整AdV E4区域，补充ΔE4而非ΔE1B55K病毒感染。HEK293细胞含有AdV E1A和E1B基因产物，补充ΔE1B55K病毒感染。(D类)如（A）所示，对dsRNA和DBP进行IFA，但将WT Ad5分为两种条件，分别用DMSO载体对照或在12 hpi时添加3μM NEDD化抑制剂MLN-4924（NEDDi）进行处理。感染的A549细胞固定在30 hpi。(电子)来自（D）的核dsRNA定量如（B）所示。对于所有IFA，比例尺（白线）显示10μm。统计显著性来源于未配对的双尾Mann–Whitneyt吨-测试，其中n.s.表示不重要，*表示P（P）<0.05，***表示P（P）< 0.001.
图4。
图4。
即使存在VA RNA，核dsRNA也可以激活PKR(A类)MOI为10时，A549细胞感染WT Ad5或缺乏E1B55K（ΔE1B，dl110）、E4区（ΔE4，dl1004）或两种VA RNA（ΔVA，dl720）的Ad5突变体后的时间-过程免疫印迹。PKR途径的激活表现为苏氨酸446处PKR的自磷酸化和丝氨酸51处eIF2α的下游磷酸化。(B类)感染A549细胞32h，获取细胞质RNA并转化为cDNA。对VA RNA I进行定量PCR，将其归一化为GAPDH水平，并用WT Ad5设置为100%表达。条形图表示平均值，误差条形图表示三个生物复制品的标准偏差（灰点）。使用非配对双尾进行统计t吨-测试，其中P（P）>0.05不显著（n.s.），且P（P）<0.05表示为*。
图5。
图5。
病毒感染期间，在dsRNA形成后，PKR重新定位到细胞核。(A类)用WT Ad5或缺乏E1B55K（ΔE1B，dl110）的Ad5突变体感染A549细胞，这些突变体同时缺乏VA RNAs（ΔVA，dl720）或缺乏E4区域（ΔE4，dl1004），MOI为10，持续38小时。进行IFA，并对细胞进行总PKR（绿色）和VRC标记DBP（洋红色）染色。细胞核用DAPI染色，细胞核外围用白色虚线勾勒。(B类)如（A）中那样感染A549细胞，并对活化的PKR（磷酸化苏氨酸451，绿色）和VRC标记物DBP（品红色）进行染色。(C)A549细胞感染32 h，进行亚细胞分离以分析细胞质（C）或核（N）隔室。保留一部分输入细胞用于全（T）细胞裂解。分馏质量由细胞质标记GAPDH和核标记组蛋白H3确认。(D类)用ΔE4病毒感染A549细胞38h，并对其进行总PKR（绿色）和9D5抗dsRNA抗体（品红色）染色。细胞核用DAPI染色，核周边用虚线勾勒。缩放区域（白框）显示不带PKR的dsRNA小斑点，或与核PKR斑点共存的dsRNA。对于所有IFA，比例尺（白线）显示10μm。
图6。
图6。
核dsRNA包括未切割的病毒转录物。(A类)A549细胞感染38 h，用9D5抗dsRNA抗体（绿色）和VRC标记物DBP（品红色）染色。细胞核用DAPI染色，核周边用虚线勾勒。比例尺（白线）表示10μm。用DMSO载体处理ΔE4感染细胞，或用5μM聚合酶抑制剂放线菌素D（ActD）、20μM RNA Pol II延伸抑制剂DRB或30μM RNA波尔III抑制剂ML-60218处理细胞，从24 hpi到固定。(B类)来自（A）的核dsRNA被量化为MNFI，每个细胞显示为一个点。dsRNA阳性阈值被定义为未感染细胞中dsRNA的MNFI的4个标准偏差，并显示为虚线。阈值以下的细胞为灰色，而核dsRNA阳性的细胞为黑色，这些阳性细胞的平均值和标准偏差用红色误差条表示。在感染每种病毒期间，表达dsRNA的总细胞百分比显示在x轴下方。曼·惠特尼t吨-测试表明，dsRNA阳性的两种情况之间并没有显著变化（n.s.）(C)使用J2抗体进行dsRNA免疫沉淀的工作流程。(D类)图中描述了用于分析E1A、三方先导（TPL）和TPL剪接L5-F纤维（Fiber）病毒转录物剪接和未剪接区域的qRT-PCR策略。外显子显示为黑线，而内含子显示为灰线。(电子)在48 hpi时从WT Ad5（黑条）或ΔE4感染（红条）A549s中获取总RNA，并用J2抗体进行dsRNA免疫沉淀。通过qRT-PCR分析RNA种类，并将其归一化为匹配输入RNA中检测到的特定转录物的百分比。病毒RNA分析为剪接（实线条）和未剪接（虚线条），并与已知的阳性对照细胞dsRNA进行比较，例如带有反向重复Alu元件的mRNA（IRAlu）或线粒体RNA（mtRNA）。阳性阈值（虚线）设置为两个阴性对照组HPRT1和GAPDH平均值的2倍。横线表示六个独立的生物复制（病毒转录本）或四个独立的生物学复制（宿主转录本）的平均值，误差横线表示标准偏差。未配对双尾t吨-测试用于确定条件之间的显著性，其中n.s.表示P（P）-值>0.05，*表示P（P）-值<0.05，以及**P（P）< 0.01.
图7。
图7。
ΔE4病毒感染的RNA富含dsRNA，并在转录组中缺失剪接连接。(A类)从Ad5-或ΔE4感染的A549s 48 hpi的两个生物重复中分别收集J2免疫沉淀的RNA和匹配的输入RNA，并进行Illumina测序（如图6C所示）。显示了每个测序库中每个输入（Inp.，黑色或红色）或J2 dsRNA-enriched RNA免疫沉淀（J2 RIP，灰色或鲑鱼）中所有唯一的、去重复的指向Ad5基因组的读取的百分比，数据点描述了两个生物复制序列，条形代表平均值，误差条形代表标准偏差。(B类)通过测定J2 RIP文库中发现的病毒RNA百分比与来自相同生物复制的匹配输入文库中病毒RNA百分比之间的倍数变化，计算病毒读取中dsRNA的富集度。条形图显示数据的平均值，误差条形图显示标准偏差。dsRNA的富集不会导致比率为1，这被描绘成一条黑色虚线。(C)剪接病毒读取被定义为病毒基因组的RNA读取映射，包含一个可复制的剪接连接（每个库和所有八个库中检测到不止一次的连接读取），并以每个库中可映射病毒读取总数的百分比进行标准化。数据分别描述了两个生物复制序列，条形图和误差条形图表示平均值和标准偏差。(D类)选择47个特异性剪接接头作为单一高表达病毒转录物的指示。连接丰度被标准化为每个图书馆和日志的总映射读数2计算J2 RIP内每个连接点与来自相同生物复制的匹配输入之间的折叠变化。方框图和胡须图显示了中位数、四分位范围和第10–90个百分位。（E）（D）中47个拼接接头中每个接头的对数2倍变化显示为一个彩色点（WT Ad5，黑色；ΔE4，红色），带有一条垂直黑线，显示两个生物复制库之间的标准偏差。拼接连接分布在x轴上，对应于任何一个剪接供体或剪接受体的基因组位置，这两个剪接受体将产生最大的数据传播。分别计算WT Ad5（灰色虚线）或ΔE4（鲑鱼虚线）的平均倍数变化。主要病毒转录单位显示为沿x轴缩放，由早期转录物（灰色）和晚期转录物（黑色）组成。主要内含子显示为浅灰色线条，箭头指示转录方向。曼·惠特尼t吨-测试用于确定条件之间的显著性。对于所有统计测试，*表示P（P）-值<0.05**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图8。
图8。
有效的病毒RNA剪接阻止dsRNA的形成。(A类)在感染WT Ad5（Ad5，黑色）或缺乏E1B55K（ΔE1B，紫色）或E4区域（ΔE4，红色）的Ad5突变体之前，用对照siRNA（实心条）或靶向RALY和hnRNPC（虚线条）的siRNA转染HeLa细胞24小时。在32 hpi时采集总RNA并进行qRT-PCR。使用6D中所示的方法检测剪接和未剪接的病毒转录物，这些RNA物种的比率描述为剪接效率。数据显示为三个独立的生物复制，条形图表示平均值，误差条形图表示标准偏差。通过非配对双尾分析显著性t吨-测试。(B类)与（A）所示条件完全匹配的免疫印迹。(C)将对照siRNA（siCTRL）或靶向RALY和hnRNPC（siRBP）的siRNA转染HeLa细胞24 h，然后感染WT Ad5、ΔE1B或ΔE4。细胞固定在32 hpi，并用9D5抗dsRNA抗体（绿色）和标记VRC的细胞蛋白（USP7，品红色）染色。细胞核用DAPI染色，核周边用虚线勾勒。比例尺（白线）表示10μm。(D类)来自（C）的核dsRNA被定量为MNFI，并且每个细胞显示为点。dsRNA阳性阈值被定义为未感染细胞中dsRNA的MNFI的4个标准偏差，并显示为虚线。阈值以下的细胞为灰色，而核dsRNA阳性的细胞为黑色，这些阳性细胞的平均值和标准偏差用红色误差条表示。在感染每种病毒期间，表达dsRNA的细胞总数的百分比显示在x轴上它们的名称下方。非配对双尾Mann–Whitney分析了显著性t吨-测试。对于所有实验，显著性显示为P（P）-值>0.5（不重要，不另说明）*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）< 0.001.
图9。
图9。
阻断病毒RNA剪接足以诱导dsRNA的形成。(A类)用WT Ad5感染A549细胞，两小时后转染15μM非靶向吗啉酸（NTC）或设计用于阻断TPL2剪接供体、TPL3剪接供者和纤维剪接受体（TPL，每个吗啉酸5μM）的吗啉酸混合物。在24 hpi时采集总RNA，并按照8A计算病毒RNA剪接效率。数据显示为三个独立的生物复制，条形图表示平均值，误差条形图表示标准偏差。通过非配对双尾分析显著性t吨-测试。(B类)A549被WT Ad5或ΔE4感染，以2 hpi转染来自（A）的吗啉酸，并在24 hpi固定IFA。细胞用9D5抗dsRNA抗体（绿色）和标记VRC的细胞蛋白（USP7，品红色）染色。细胞核用DAPI染色，核周边用虚线勾勒。比例尺（白线）表示10μm。(C)来自（B）的核dsRNA被量化为MNFI，每个细胞显示为一个点。dsRNA阳性阈值被定义为未感染细胞中dsRNA的MNFI的4个标准偏差，并显示为虚线。阈值以下的细胞为灰色，而核dsRNA阳性的细胞为黑色，这些阳性细胞的平均值和标准偏差用红色误差条表示。在感染每种病毒期间，表达dsRNA的细胞总数的百分比显示在x轴上它们的名称下方。非配对双尾Mann–Whitney分析了显著性t吨-测试。对于所有实验，显著性显示为P（P）-值>0.5（不重要，不另说明）**P（P）<0.01和***P（P）< 0.001.
图10。
图10。
描述重叠病毒转录物的低效剪接如何导致分子间dsRNA形成的模型。在野生型病毒感染期间，E1B55K/E4orf6病毒劫持泛素连接酶的存在导致细胞RNA结合蛋白（RBPs）RALY和hnRNPC的泛素化，从而阻止它们与病毒RNA的结合，导致病毒RNA的外显子区域与来自相反链的转录物的内含子区域之间形成dsRNA。在这些dsRNA分子形成后，一部分细胞质dsRNA-sensor PKR转位到细胞核，在那里它与病毒dsRNA共同定位，并被自身磷酸化激活。
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