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.2022年6月；71(6):1371-1392.
doi:10.1007/s00262-021-03057-5。 Epub 2021年10月19日。

CD4+T细胞在地方性Burkitt淋巴瘤中发现，并调节Burkitt-淋巴瘤前体细胞的活性和致病相关Epstein-Barr病毒基因的表达

塞姆琼·西多罗夫 1, 劳拉·福克斯 2, 卡贾·斯坦纳 2, Samyo Bounlom公司 2, Sabrina Traxel公司 2, 塔里克·阿齐 2, Arbeneshe贝里沙 三 4, 克里斯托夫·伯杰 2, 米歇尔·贝纳斯科尼 2 5 6, 菲利克斯·K·尼格利 2, 伊冯·佩纳 7, Sugeshnee Pather公司 7, 沃纳·坎普夫 三 4, 大卫·纳达尔 2, 西蒙·比格勒 8
附属公司

CD4+T细胞在地方性Burkitt淋巴瘤中发现，并调节Burkitt-淋巴瘤前体细胞的活性和致病相关Epstein-Barr病毒基因的表达

塞姆琼·西多罗夫等。 癌症免疫疗法. 2022年6月.

摘要

地方性Burkitt淋巴瘤（eBL）是一种侵袭性B细胞癌，其特征是IgH/c-myc易位和携带EB病毒（EBV）。越来越多的证据表明CD4+T细胞可能参与eBL的发病机制。在这里，我们研究了CD4+T细胞在原发性eBL组织中的存在及其对EBV感染前eBL细胞模型的潜在二分法影响，该模型使用体外材料和体外共培养。此外，我们建立了一种新的方法来研究IgH/c-myc易位在原代B细胞中的作用，方法是利用CRISPR/Cas9敲除方法引入并标记新的易位。我们史无前例地证明CD4+T细胞存在于原发性eBL肿瘤组织中。此外，我们证明CD4+T细胞一方面通过在体外杀死缺乏IgH/c-myc易位的前eBL细胞来抑制eBL的发育，另一方面通过诱导前eLB细胞中关键的EBV潜伏期III转换为潜伏期I来间接促进eBL发育。最后，我们表明，虽然仅存在IgH/c-myc易位不足以逃避体外CD4+T细胞介导的杀伤，体内CD4+T细胞介导的EBV潜伏期III程序抑制可能使携带IgH/c-myc易位和额外突变的细胞逃避免疫控制，并通过解除c-myc活性的调控而增殖，从而导致肿瘤形成。因此，我们的研究强调了CD4+T细胞的二分法效应和eBL发病机制，提出了它们对eBL进展的影响机制，并为进一步研究IgH/c-myc易位提供了一种新的体外模型。

关键词：CRISPR/CAS9；地方性Burkitt淋巴瘤；爱泼斯坦-巴尔病毒；IgH/c-myc易位；延迟III至延迟I开关；T辅助细胞。

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数字

图1
图1
CD4+T细胞存在于原发性eBL组织中。对13例eBL患者活检样本的记录进行CD3、CD4和CD8标记物染色。一一位代表性eBL患者（BL13）的CD3、CD4和CD8染色图像，分辨率为5×或20×。在5倍分辨率下，所有图像的测量条为200μm，在20倍分辨率下测量条为50μm。b条用于分析的13名患者的平均IHC评估分数。对采用配对单因素方差分析（ANOVA）和Sidak检验进行多重比较。对 > 0.05不显著（n.s.），对 < 0.1*
图2
图2
CD4+T细胞对LCL增殖、细胞周期和生存能力的影响。LCL单独或以不同比例与使用抗CD3/CD28珠激活的扩张自体CD4+T细胞共同培养9天。在给定时间采集细胞，用流式细胞仪进行染色和分析。基于CD19的表达对LCL进行预门控。所示为3名TMC捐赠者阳性细胞平均百分比的平均值±SD一使用Click-iT流式细胞术试剂盒测量EdU+LCL的平均百分比。对采用双向方差分析（ANOVA）和Sidak检验进行多重比较。对 > 0.05不显著（n.s.）b条使用EdU Click-iT流式细胞仪试剂盒和FxCycle染料测量不同细胞周期阶段的LCL平均百分比。c（c）使用Annexin V染色和Zombie Viability染色测量死亡、凋亡和存活LCL的平均百分比。d日直方图覆盖用于对来自一个代表性供体的EdU+和EdU-细胞进行选通。e（电子）假彩色图用于细胞周期G1、G2和S期细胞的选通，用于一个代表性供体的细胞周期分析。（f）用于门控活细胞、凋亡细胞和死细胞的伪彩色图，用于一个代表性供体的凋亡测定
图3
图3
CD4+T细胞对LCL EBV潜伏期和EBV基因表达的影响。LCL单独或以不同比例与使用抗CD3/CD28珠激活的扩张自体CD4+T细胞共同培养7天。在给定的时间点，收集细胞并使用CD19+珠和autoMACS分离LCL。不同的符号代表不同的条件，而不同的颜色代表不同的TMC供体。对采用双向方差分析（ANOVA）和Sidak检验进行多重比较。对 > 0.05不显著（n.s.），对 < 0.1*,对 < 0.01**,对 < 0.001***. 用于量化的WB图像可以在补充图1中找到。一 欧洲银行业协会2和LMP1系列用qRT-PCR测定T细胞/LCL比值为5:1时的表达。所示为归一化为几何平均值的dCt值的平均值±SDTBP（待定）和YWHAZ公司.b条总计欧洲银行业协会2蛋白质表达通过Western blotting进行评估。Western blot图像被量化并标准化为β-肌动蛋白作为加载控制。所示为标准体积的平均值±SD欧洲银行业协会2乐队。c（c）Cp和Qp启动子在5∶1的T细胞/LCL比率下的使用使用使用qRT-PCR测定。所示为归一化为几何平均值的dCt值的平均值±SDTBP（待定）和YWHAZ公司。 d日总计LMP1系列使用蛋白质印迹法评估蛋白质表达。Western blot图像被量化并归一化为β-肌动蛋白作为负荷对照。所示为标准化体积的平均值±SDLMP1系列乐队
图4
图4
体外T细胞-LCL共培养系统中共刺激分子和T辅助亚相关标记的表达。LCL单独培养或与使用抗CD3/CD28珠激活的扩张自体CD4+T细胞的LCL/T细胞比率为1:3的混合培养。CD4+T细胞单独培养，用珠激活或休息作为对照。共培养5天后，收获细胞，进行染色并使用流式细胞仪进行分析。根据CD19表达对LCL进行预先门控。根据CD4表达对T细胞进行预先门控。用等型染色法检测阳性细胞。所示为平均荧光强度（MFI）或阳性细胞百分比的平均±SD。不同的符号代表不同的条件，而不同的颜色代表不同的TMC供体。一个有代表性的供体的直方图叠加可以在补充图2中找到。一,b条平均荧光强度（MFI）(一)和阳性细胞百分比(b条)用于在LCL上表达表面共刺激分子。c（c）,d日平均荧光强度（MFI）（c）和阳性细胞百分比(d日)用于CD4+T细胞表面共刺激分子的表达。e（电子）,（f）平均荧光强度（MFI）(e（电子）)和阳性细胞百分比(（f）)用于CD4+T细胞中细胞因子的产生和转录因子的表达。克一个代表性供体CD40L表达的直方图覆盖。小时共培养5天后，使用CD19+微球和自体MACS通过阴性选择分离CD4+T细胞。使用qRT-PCR测定基因表达。所示为归一化为几何平均值的dCT值的平均值±SD波兰2A,UBC公司和TBP（待定）
图5
图5
生成和验证IgH/c-myc抗体 + 低成本信用证。一生成IgH/c-myc抗体 + LCL。b至eLCL系用电穿孔IgH/c-myc抗体靶向CAS9 RNP并使用含有CMV-GFP插入物的ssDNA模板。细胞生长14天，然后使用FACS对GFP+细胞进行分类。使用流式细胞术评估GFP信号和相关易位的存在(b条)和嵌套PCR(c（c）). 对nPCR分析中突出显示的PCR条带进行测序，以确认条带的一致性(d日). 存在IgH/c-myc抗体双亲FISH证实了易位(e（电子）). 在补充图5中可以找到对其他供体进行的重复
图6
图6
的影响IgH/c-myc抗体LCL表型易位。有或无四名捐赠者的LCLIgH/c-myc抗体易位在相同密度下培养3天，比较易位对LCL表型的影响。不同的符号代表不同的条件，而不同的颜色代表不同的TMC供体。对数值采用配对t检验计算。对 > 0.05不显著（n.s.）。在流式细胞术实验中，采用同型染色法检测阳性细胞。一个具有代表性的供体的直方图叠置可以在补充图8中找到。用于量化的WB图像可以在补充图6中找到。一通过血细胞仪每日计数和使用EdU Click-iT流式细胞仪试剂盒进行EdU掺入分析来评估LCL的增殖。b条使用僵尸活性染料评估LCL活性。c）使用EdU Click-iT流式细胞术试剂盒和FxCycle染料测量不同细胞周期阶段的LCL百分比。d日用Western blotting评估总蛋白表达。对蛋白质印迹图像进行定量，并将其标准化为β-肌动蛋白作为负载对照。所示为相应频带归一化体积的平均值±SD。e–f使用qRT-PCR测定基因表达。所示为归一化为几何平均值的dCt值的平均值±SDTBP（待定）和YWHAZ公司。 克,d日表面共刺激分子的表达(克)和EBV/eBL相关标记(小时)采用流式细胞仪进行评估。所示为平均荧光强度（MFI）的平均值±SD
图7
图7
CD4+T细胞对小鼠淋巴细胞增殖和生存能力的影响IgH/c-myc抗体 + LCL有或无LCLIgH/c-myc抗体易位细胞单独或与不同比例的扩张自体CD4+T细胞（使用抗CD3/CD28珠激活）共同培养9天。在给定的时间点，收集细胞，用流式细胞仪进行染色和分析。根据CD19表达对LCL进行预先门控。所示为三个TMC供体阳性细胞平均百分比的平均值±SD。对使用双向方差分析（ANOVA）和Tukey检验计算值，用于多重比较。对 > 0.05不显著（n.s.），对 < 0.1*,对 < 0.01**,对 < 0.001***,对 < 0.0001****. 补充图7中可以找到T细胞/LCL比率为1:1的重复。一通过CD19和CD4染色测定共培养中LCL的平均百分比。b条使用Annexin V染色和Zombie Viability染色测量死亡、凋亡和存活LCL的平均百分比。c（c）GFP+LCL的平均百分比。d日使用Click-iT流式细胞术试剂盒测量EdU+LCL的平均百分比
图8
图8
CD4+T细胞对小鼠卵巢癌基因表达的影响IgH/c-myc抗体 + 低成本信用证。有或无LCLIgH/c-myc抗体将易位细胞单独培养或与不同比例的扩张自体CD4+T细胞（使用抗CD3/CD28珠激活）共同培养7天。在给定的时间点，收集细胞并使用CD19+珠和autoMACS分离LCL。使用qRT-PCR测定基因表达。所示为归一化为几何平均值的dCt值的平均值±SDTBP（待定）和YWHAZ公司不同的符号代表不同的条件，而不同的颜色代表不同的TMC供体。对使用双向方差分析（ANOVA）和Tukey检验计算值，用于多重比较。对 > 0.05不显著（无统计学意义），对 < 0.1*,对 < 0.01**,对 < 0.001***,对 < 0.0001****
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