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.2021年10月7日；13(19):5019.
doi:10.3390/cancers13195019。

TSP-1靶向卵巢癌：CD47拮抗剂TAX2激活抗肿瘤免疫

阿尔宾·珍妮 1 2 三 4, 托马斯·萨拉津 2 三, 马加里·查理 1 2 三, 凯瑟琳·莫阿利 5, 卡罗琳·菲切尔 6, 卡米尔·博拉尼翁·隆比 三 7, 马蒂·卡勒瓦特 8, 玛丽·克里斯汀·安德里 8, 埃里克·迪西斯 9, 弗雷德里克·德洛姆 5 9, 达米安·里乌尔 10, 圣埃芬·德迪厄 2 三 4
附属公司

TSP-1靶向卵巢癌：CD47拮抗剂TAX2激活抗肿瘤免疫

阿尔宾·珍妮等。 癌症（巴塞尔）. .

摘要

TAX2肽是一种环状肽，作为血小板反应蛋白-1（TSP-1）与CD47相互作用的正构拮抗剂。TAX2首次被描述为具有抗血管生成活性，并在许多临床前模型中显示出抗癌功效。在这里，我们旨在提供TAX2作用模式的广泛分子特征，同时评估其在卵巢癌治疗中的潜力。采用多学科方法从稳定性、溶解度和效价方面鉴定TAX2候选药物。然后，在卵巢癌相关小鼠模型中进行疗效研究和基准实验。TAX2肽在临床相关溶剂中稳定且可溶，同时显示出良好的安全性。此外，临床数据挖掘允许将TSP-1确定为卵巢癌的相关药理靶点。在小鼠中，TAX2治疗抑制卵巢肿瘤生长和转移扩散，同时激活抗癌适应性免疫。有趣的是，当与抗PD-1免疫检查点抑制剂联合使用时，TAX2也具有协同作用。总之，我们的数据显示TAX2是一个具有高级临床前特征的优化候选。利用相关的同基因卵巢癌模型，我们强调了TAX2将免疫原性较差的肿瘤转化为显示有效抗肿瘤T细胞免疫的肿瘤的能力。

关键词：CD47；TSP-1；免疫治疗；卵巢癌；肽。

PubMed免责声明

利益冲突声明

A.J.和S.D.分别担任科学和临床咨询委员会主席和主席，并拥有Apmonia Therapeutics（法国兰斯）的股权，该公司授权TAX2技术用于开发。其他作者声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
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TAX2候选药物的分子特征。(一)TAX2肽的分子表示，显示了“核心”SQLLKG活性序列（灰色）以及a.a.侧链（绿色、红色和蓝色）和C-C二硫键（黄色）的螺旋折叠，如VMD 1.9.3软件所示。(b条)TAX2肽的物理化学性质。在TAX2肽序列（CEVSQLLKGDAC）中，半胱氨酸以黄色表示，酸性残基以粉红色表示，脂肪族残基以灰色表示，极性残基以绿色表示，碱性残基以蓝色表示。图中显示了TAX2的化学式和分子量，而图中显示的是从PepCalc在线工具中获得的肽的净电荷与pH值的关系(www.pepcalc.com（百事可乐）; Innovagen AB公司；2018年2月22日访问）。(c（c）)TAX2肽质量控制：分析TAX2的C18反相HPLC图谱（λ=215 nm），表明通过Fmoc化学合成的肽的均一性和纯度。(d日)双电荷TAX2肽的ESI-MS光谱（正离子模式；母体离子米/z= 632.32). (e（电子）)稳定性分析：在RP-HPLC分析之前，对TAX2肽（冻干和/或在H2O溶液中重组）应用了几种储存条件和处理程序，获得的纯度结果见表。产品和溶液外观也得到了控制，而ESI-MS分析表明，根据CPTAC分析表征指南，所有测试参数之间的参考光谱保持不变(https://analysis癌症.gov). (（f）)大鼠血浆中TAX2肽稳定性的评估：从Sprague-Dawley大鼠新鲜收集的500µL EDTA血浆中加入标称浓度为50 ng·mL的TAX2肽类−1并在4°C（蓝色）或室温（红色）下培养2小时。通过HPLC–MS/MS检测剩余的TAX2，每30分钟评估一次血浆浓度(n个=每种情况2）。结果以T0时浓度的百分比表示。(克)TAX2溶解度测定：以递增剂量（0.25至20 mg·mL）溶解TAX2肽−1)在MilliQ水中，用15 mM Tris缓冲0.9%NaCl或0.9%NaCl。使用NanoVue PlusTM光谱仪（路径长度：0.05 cm）测量205 nm处的样品吸光度。根据参考文献[27]测定205 nm处的TAX2肽摩尔吸光率（消光系数），以便在吸光度与浓度的线性范围内通过多次测量计算TAX2浓度。然后将计算的浓度与粉末称量（根据肽纯度和含量进行校正）进行比较，以估计溶解速率。(小时)在0.9%NaCl中以不同浓度（0.5、1,2.5、5、10、15、20和25 mg·mL）临时制备的TAX2肽溶液的尺寸（流体动力学直径）分布（以数字%表示）−1). 通过动态光散射测量评估粒度分布，并使用Malvern Zetasizer v7.13进行分析。Insert显示使用PyMOL分子图形系统v.2.1.1（Schrödinger LLC，New York，NY，USA）建模的TAX2肽单体，计算出的最大尺寸为17.8º。(我–我)表面等离子体共振结合分析。对于每个图，显示了三个代表性实验中的一个。(我)在固定化rmTSP-1（2931RU）上以30µL.min-1的流速注射120 s的TAX2（红色）或扰乱肽（黄色，均为1mM）的相互作用(j个)TAX2肽结合（红色：15.625、31.25、62.5、125和250µM）与固定化rmTSP-1结合的浓度依赖性，如使用单循环动力学分析实验所确定的（即，在相同循环中连续注入样品，样品注入之间无再生）。黑线显示了使用Biacore T200评估软件v3.1（GE Healthcare Limited，Chicago，IL，USA）（“两态反应”模型）获得的最佳拟合，该模型也用于测定动力学参数。(k个，我)通过接触时间实验验证TAX2:TSP-1相互作用的两态结合模型。图中显示了固定化rmTSP-1上TAX2肽在180 s（红色）和600 s（黑色）两种不同暴露时间下的调整后结合曲线(k个). 曲线与分析物注射终点的对齐显示600 s注射后解离率降低，显示出稳定的构象变化。(我)直方图显示了在30、180和600秒时从三个独立实验测得的分离率（平均值±SEM，t吨-测试*对< 0.05). (米)利用两态反应模型获得TAX2:TSP-1相互作用的动力学参数。K的平均值±SEM值D类，k在和k远离的表中提供了三个类似实验的计算值。
图1
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TAX2候选药物的分子特征。(一)TAX2肽的分子表示，显示了“核心”SQLLKG活性序列（灰色）以及a.a.侧链（绿色、红色和蓝色）和C-C二硫键（黄色）的螺旋折叠，如VMD 1.9.3软件所示。(b条)TAX2肽的物理化学性质。在TAX2肽序列（CEVSQLLKGDAC）中，半胱氨酸以黄色表示，酸性残基以粉红色表示，脂肪族残基以灰色表示，极性残基以绿色表示，碱性残基以蓝色表示。图中显示了TAX2的化学式和分子量，而图中显示的是从PepCalc在线工具中获得的肽的净电荷与pH值的关系(www.pepcalc.com（百事可乐）; Innovagen AB公司；2018年2月22日访问）。(c（c）)TAX2肽质量控制：分析TAX2的C18反相HPLC图谱（λ=215 nm），表明通过Fmoc化学合成的肽的均一性和纯度。(d日)双电荷TAX2肽的ESI-MS光谱（正离子模式；母体离子米/z=632.32）。(e（电子）)稳定性分析：在RP-HPLC分析之前，对TAX2肽（冻干和/或在H2O溶液中重组）应用了几种储存条件和处理程序，获得的纯度结果见表。产品和溶液外观也得到了控制，而ESI-MS分析表明，根据CPTAC分析表征指南，所有测试参数之间的参考光谱保持不变(https://analysis癌症.gov). (（f）)大鼠血浆中TAX2肽稳定性的评估：从Sprague-Dawley大鼠新鲜收集的500µL EDTA血浆中加入标称浓度为50 ng·mL的TAX2肽类−1并在4°C（蓝色）或室温（红色）下孵育2小时。每隔30分钟通过HPLC–MS/MS检测剩余TAX2评估血浆浓度(n个=每种情况2）。结果以T0时浓度的百分比表示。(克)TAX2溶解度测定：以递增剂量（0.25至20 mg·mL）溶解TAX2肽−1)在MilliQ水中，用15 mM Tris缓冲0.9%NaCl或0.9%NaCl。使用NanoVue PlusTM光谱仪（路径长度：0.05 cm）测量205 nm处的样品吸光度。根据参考文献[27]测定205 nm处的TAX2肽摩尔吸收率（消光系数），以便在吸光度与浓度的线性范围内通过多次测量计算TAX2浓度。然后将计算的浓度与粉末称重（针对肽纯度和含量进行校正）进行比较，以估计增溶速率。(小时)在0.9%NaCl中以不同浓度（0.5、1,2.5、5、10、15、20和25 mg·mL）临时制备的TAX2肽溶液的尺寸（流体动力学直径）分布（以数字%表示）−1). 通过动态光散射测量评估粒度分布，并使用Malvern Zetasizer v7.13进行分析。Insert显示使用PyMOL分子图形系统v.2.1.1（Schrödinger LLC，New York，NY，USA）建模的TAX2肽单体，计算出的最大尺寸为17.8º。(我–我)表面等离子体共振结合分析。对于每个图，显示了三个代表性实验中的一个。(我)以30µL.min-1的流速在固定化rmTSP-1（2931 RU）上注射TAX2（红色）或搅乱肽（黄色，均为1 mM）120 s后的相互作用(j个)TAX2肽结合（红色：15.625、31.25、62.5、125和250µM）与固定化rmTSP-1结合的浓度依赖性，如使用单循环动力学分析实验所确定的（即，在相同循环中连续注入样品，样品注入之间无再生）。黑线显示了使用Biacore T200评估软件v3.1（GE Healthcare Limited，Chicago，IL，USA）（“两态反应”模型）获得的最佳拟合，该模型也用于测定动力学参数。(k个，我)通过接触时间实验验证TAX2:TSP-1相互作用的两态结合模型。图中显示了固定化rmTSP-1上TAX2肽在180 s（红色）和600 s（黑色）两种不同暴露时间下的调整后结合曲线(k个). 曲线与分析物注射终点的对齐显示600 s注射后解离率降低，显示出稳定的构象变化。(我)直方图显示了在30、180和600秒时从三个独立实验测得的分离率（平均值±SEM，t吨-测试*对< 0.05). (米)利用两态反应模型获得TAX2:TSP-1相互作用的动力学参数。K的平均值±SEM值D类，k在和k远离的表中提供了三个类似实验的计算值。
图2
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卵巢癌中TSP-1和CD47表达与患者预后的相关性：临床数据的综合回顾。(一)20种癌症类型中TSP-1蛋白表达分析。直方图显示了IHC（经验证的抗体：CAB033678）对每种癌症类型TSP-1阳性的患者百分比，这是从人类蛋白质图谱（可从网址：www.proteinalas.org; 2018年1月11日访问）。(b条，c（c）)正常卵巢和卵巢癌组织芯片中TSP-1和CD47 IHC的显微照片(b条)人类蛋白质图谱数据集，以及(c（c）)兰斯医院队列。(d日)的结果泰铢1（探头：201110_s_at）和CD47型使用Oncomine检索到的TCGA数据集之间的（213857_s_at）差异基因表达分析（log2，以中位数为中心；Affymetrix U133信号）TM（TM）平台。方框显示中位数和四分位间距，而胡须的底部和顶部条形表示10第个和90第个百分位数。还显示了最小/最大值（项目符号），更多详细信息见补充材料表S1。(e（电子）)的绘图泰铢1基因表达（log2；Affymetrix U133信号）与血管侵袭以及淋巴血管侵袭临床属性的对比，仅使用cBio Portal在TCGA卵巢癌患者中检索。学生的t吨-测试对-显示值。(（f）)拳击表演泰铢1公开可用的OC元数据库（SurvExpress工具）中跨风险组的表达式，包括对-差异值测试，使用t吨-测试。热图显示泰铢1在风险组中表达，绿色等级低表达，红色等级高表达。计算βCox拟合的系数（即基因表达和预后指数之间的线性关系）为0.908泰铢1基因（与对-值=0.016）。(克，小时)Kaplan–Meier分析(克)总体(n个=1656）和(小时)无进展(n个=1435）OC患者的生存率（KM-plotter数据集）按泰铢1或CD47型表达式。对数秩检验对-指示值。
图2
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卵巢癌中TSP-1和CD47表达与患者预后的相关性：临床数据的综合回顾。(一)20种癌症类型中TSP-1蛋白表达分析。直方图显示了IHC（经验证的抗体：CAB033678）对每种癌症类型TSP-1阳性的患者百分比，这是从人类蛋白质图谱（可从网址：www.proteinalas.org; 2018年1月11日访问）。(b条，c（c）)正常卵巢和卵巢癌组织芯片中TSP-1和CD47 IHC的显微照片(b条)人类蛋白质图谱数据集，以及(c（c）)兰斯医院队列。(d日)的结果泰铢1（探头：201110_s_at）和CD47型使用Oncomine检索到的TCGA数据集之间的（213857_s_at）差异基因表达分析（log2，以中位数为中心；Affymetrix U133信号）TM（TM）平台。方框显示中位数和四分位间距，而胡须的底部和顶部条形表示10第个和90第个百分位数。还显示了最小/最大值（项目符号），更多详细信息见补充材料表S1。(e（电子）)的绘图泰铢1基因表达（log2；Affymetrix U133信号）与血管侵袭以及淋巴血管侵袭临床属性的对比，仅使用cBio Portal在TCGA卵巢癌患者中检索。学生的t吨-测试对-指示值。(（f）)拳击表演泰铢1公共可用OC元数据库（SurvExpress工具）中跨风险组的表达，包括对-差异值测试，使用t吨-测试。热图显示泰铢1在风险组中表达，绿色等级低表达，红色等级高表达。计算βCox拟合的系数（即基因表达和预后指数之间的线性关系）为0.908泰铢1基因（与对-值=0.016）。(克，小时)Kaplan–Meier分析(克)总体(n个=1656）和(小时)无进展(n个=1435）OC患者的生存率（KM-plotter数据集）按泰铢1或CD47型表达式。对数秩检验对-指示值。
图3
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A2780和SK-OV-3异种移植模型中TAX2肽的治疗评估。(一) 5 × 106将A2780或SK-OV-3人卵巢癌细胞皮下植入BALB/c裸鼠体内，然后腹腔注射载体（0.9%NaCl）或TAX2肽（10 mg·kg）−1BW）每周进行3次，持续2周（A2780模型：b条到d日或7周（SK-OV-3型号：e（电子）到克) (n个=每组18–22人）。在第13天首次给药之前，我们确保各组之间的平均肿瘤体积具有可比性。在给药开始时，注意皮下异种移植物已经建立了由微型计算机断层扫描控制的肿瘤血管系统。定期检查小鼠的体重、肿瘤体积和临床症状。(b条，e（电子）)小鼠体重的演变（平均值±SEM）。(c（c），（f）)在第一只动物到达安乐死终点（>1 cm）之前，单个计算肿瘤体积的散点图三)，即第19天(c（c）：A2780型号）和第70天(（f）：SK-OV-3模型），仅考虑在所述时间点有可触及且可测量肿瘤的小鼠。中线（Mann–Whitney单位测试*对< 0.05). (d日，克)单个动物肿瘤体积的演变（mm）三.
图4
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TAX2用作抗肿瘤免疫调节药物的机理验证研究。在上皮性卵巢癌的两个同基因模型中研究了TAX2肽处理对抗肿瘤免疫反应激活的影响。我们接种了5×106ID8细胞皮下或腹腔注射至C57BL/6JRj小鼠，以模拟原发性肿瘤生长(一–小时)和转移性播散（腹膜癌，我–我)分别是。TAX2处理（30 mg·kg−1分别对皮下注射和静脉注射ID8模型每周进行三次BW）和溶媒注射（0.9%NaCl），持续4周和8周(n个=两种型号每组11个）。(一–小时)皮下卵巢癌同种异体移植物的IHC染色，用于分析血管/淋巴血管特征以及免疫细胞浸润情况。(一)肿瘤内血管结构CD31免疫染色的代表性显微照片。直方图显示了整个肿瘤切片中CD31-阳性像素百分比的自动量化结果（平均值±SEM，Mann-Whitney U检验；n.s.，不显著）。(b条)淋巴管密度分析。所示为显微镜视图，直方图显示了5个高倍视野（HPF）中Lyve-1阳性功能性淋巴管的数量，这是由一位对治疗一无所知的病理学家确定的（平均值±SEM，Mann-Whitney U检验*对< 0.05). (c（c）–（f）)CD4免疫染色后皮下移植瘤切片的宏观视图（×20倍放大）(c（c），左侧面板）。直方图(c（c），右侧面板）显示整个肿瘤切片中CD4阳性像素百分比的自动量化结果（平均值±SEM，Mann-Whitney U检验***对<0.001），而CD4阳性沿着肿瘤的最大尺寸分布(d日)显示为相对于距离（单位：µm）绘制的灰度值。对于IHC，病理学家盲目排除不符合质量控制的染色。为了确认CD4免疫染色对肿瘤浸润淋巴细胞（TiLs）的特异性，CD4阳性细胞在每只动物10个HPF中计数(e（电子），平均值±SEM，Mann-Whitney U检验*对<0.05），然后建立CD4阳性浸润性TiL数量与肿瘤体积变化百分比之间的相关性(（f）). 进行线性回归（黑线）第页确定了非参数双尾Spearman检验产生的系数(对= 0.0004). (克，小时)CD8-阳性细胞毒性T细胞(克)以及CD163阳性巨噬细胞(小时)也按每只动物10 HPF计算（直方图显示平均值±SEM，Mann-Whitney U检验；未统计，不显著）。(我–k个)流式细胞术检测腹膜免疫细胞表型。处死后，从ID8荷瘤小鼠中取出腹水，以300 g的浓度旋转10分钟，以分离细胞成分。进行腹腔灌洗，从没有腹胀的小鼠中获得常驻细胞。对细胞进行CD3、CD45R、CD4和CD8阳性染色，然后进行流式细胞术分析。(我)计算每个标记物阳性的淋巴细胞总数百分比，并显示为平均值±SEM(j个)CD4的比例+和CD8+还计算了CD3中的细胞+T细胞群。(k个)采用ELISA法评估腹水或腹腔灌洗液中非细胞部分的IFN-γ生成，并显示为对照组的百分比（平均值±SEM）。
图5
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皮下同基因ID8卵巢癌同种异体移植物的治疗评估：TAX2单药治疗和联合抗PD-1单克隆抗体。(a–c)ID8小鼠卵巢上皮细胞系的特性。(一)免疫组化显示，C57BL/6小鼠接种ID8可导致皮下（左侧）或腹膜（右侧）肿瘤形成，ID8肿瘤细胞均大量表达TSP-1（即TAX2肽直接分子靶点）。(b条，c（c）)Western blot分析证实ID8细胞(b条)培养时在细胞外培养基中释放TSP-1，而(c（c）)它们也在细胞表面表达PD-L1蛋白（箭头所示）。相应的未剪切免疫印迹显示在补充材料图S1中。(d–g)5×106将ID8细胞皮下植入C57BL/6JRj小鼠，以重演皮下肿瘤形成(d日). 在第145天（即，当平均肿瘤体积达到100–200 mm时三)，小鼠被随机分配（每组11只），然后接受以下静脉注射治疗：0.9%NaCl（100µL，每周三次，黑圈），TAX2肽（30 mg·kg−1小鼠体重，每周三次，蓝色三角形），抗鼠PD-1单克隆抗体（200微克，每周两次，棕色方块）和TAX2/抗PD-1联合治疗（红色钻石）。治疗持续4周，期间监测肿瘤生长。(e（电子）)肿瘤体积的演变表示为治疗开始时计算肿瘤体积的百分比（平均值±SEM）。箭头表示治疗时间点。(（f）)散点图显示第175天（即开始治疗后30天）的单个肿瘤体积，中间值显示为黑线（Mann-Whitney U检验*对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001). 在TAX2和联合治疗组中，空白符号（蓝色△ 或红色◊) 代表出现广泛肿瘤坏死和/或肿瘤缩小的动物，其肿瘤体积计算为0.5×L×W2因此可能会人为地升高。(克)直方图显示肿瘤体积的个别百分比变化，按f）中所述进行计算（以治疗开始日为参考）。对照组的肿瘤生长以平均值±SEM表示，而带星号的棋盘格图案条代表坏死和塌陷的肿瘤。无论尸检后观察到什么样的坏死，直方图所代表的数值都没有校正因素。(小时)HES染色的ID8皮下肿瘤的显微照片，突出显示TAX2治疗下的广泛中央肿瘤坏死。
图6
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腹膜转移癌原位同基因模型的验证。(一–克) 5 × 106将ID8细胞腹腔内植入C57BL/6JRj小鼠，以重现腹膜转移扩散(一). 第14天，将小鼠随机分组(n个=11/组），然后接受以下静脉注射治疗：0.9%NaCl（100µL，每周三次，黑圈），TAX2肽（30 mg·kg−1小鼠体重，每周三次，蓝色三角形），抗鼠PD-1单克隆抗体（200微克，每周两次，棕色方块）和TAX2/抗PD-1联合治疗（红色钻石）。治疗持续8周，期间监测腹胀（反映腹水分泌）。(b条)腹部矢状径的演变，表示为治疗开始时测量直径的百分比（平均值±SEM）。(c（c）)散点图显示了第94天（即治疗开始后80天）的个体矢状腹部直径，中位数显示为黑线（Mann–Whitney U检验*对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001). (（f）)研究结束时小鼠的代表性照片。(d日-e（电子）)直方图显示腹膜肿瘤结节总数(d日)以及直径超过1mm的肿瘤结节(e（电子）)，在小鼠尸检过程中计数，表示为平均值±SEM（Mann-Whitney U检验*对<0.05时**对<0.01）。(克)对照组和联合治疗组的大体尸检评估（箭头表示腹腔内肿瘤肿块）。
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