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.2022年3月；75(3):567-583.
doi:10.1002/hep.32173。 Epub 2021年12月15日。

斑马鱼Alagille综合征模型中Fgf依赖性肝外祖细胞龛的肝内胆管细胞再生

赵成建 1 2, 约瑟夫·兰克曼 1, 易阳 2, 基思·P·盖茨 1, 丹曹 2, 林赛·巴斯克 三, 乔纳森·马塔隆加 1, 潘香玉 2, 何嘉业 4, 艾莉莎·格雷夫斯 4, Jan Huisken先生 4 5, 陈冲（Chong Chen） 2, P Duc Si Dong先生 1 6
附属公司

斑马鱼Alagille综合征模型中Fgf依赖性肝外祖细胞龛的肝内胆管细胞再生

赵成建等。 肝病学. 2022年3月.

摘要

背景和目标：Alagille综合征（ALGS）是一种先天性疾病，由Notch配体基因JAGGED1突变引起，导致新生儿肝内胆管（IHD）细胞丢失和胆汁淤积。某些ALGS患者的胆汁淤积症可以缓解，提示IHD细胞再生。然而，在锯齿状缺失后驱动IHD细胞再生的机制尚不清楚。在这里，我们表明，在斑马鱼中，由于IHD细胞的发育缺失而导致的胆汁淤积可以通过复合jagged1b和jagged2b突变或敲除而持续出现。

方法和结果：利用幼年斑马鱼锯齿状敲除的短暂性，我们发现jagged表达的恢复通过Notch依赖性机制导致IHD细胞的强大再生。将多谱系追踪策略与全生命三维成像相结合，我们证明肝外导管（EHD）是有助于IHD细胞再生而非发育的多潜能祖细胞的主要来源。肝细胞向IHD细胞的转分化是可能的，但很少检测到。EHD中的祖细胞增殖并迁移到肝脏，同时Notch信号丢失，如果Notch信号增加，则分化为IHD细胞。利用可诱导显性阴性Fgf受体进行的组织特异性镶嵌分析表明，来自周围间充质细胞的Fgf信号通过直接阻止早期分化和EHD祖细胞分配到肝脏来维持肝外生态位。事实上，成年小鼠EHD类器官的转录谱和功能分析揭示了它们相对于IHD类器官的独特分化和增殖潜力。

结论：我们的数据显示，IHD细胞在Jagged/Notch信号恢复后，从Fgf依赖的肝外干细胞生态位产生的多能干细胞祖细胞再生。我们假设，如果通过正常随机变异、基因治疗或Notch激动剂增强Jagged/Notch信号传导，ALGS患者的IHD细胞再生可能会增强。

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数字

图1。
图1.肝内导管细胞的发育损失在Jagged/Notch信号恢复后再生。
（A）野生型（wt）斑马鱼胚胎期（72 hpf）和幼年期（6 dpf和9 dpf）肝脏与IHD细胞和jag1b/2b型突变体(jag1b−/−；2b−/−）没有IHD细胞。IHD细胞（tp1:GFP+/Prox1+/Alacama+/Anx4a+）；肝细胞（Hnf4a+/Prox1a+）。F-actin（指骨样蛋白+）染色显示突变体中的胆汁淤积玫瑰花结（洋红色箭头）。（B）BODIPY生命标记显示导管胆汁在wt中流动，但在突变体中显示为聚集的液滴（洋红色箭头）。白色虚线表示肝缘；GB：胆囊；EHD：肝外导管；Mdr1染色显示，在突变株中，胆管沿IHD分布，但在胆汁淤积玫瑰花结（洋红色箭头）的中心密集聚集；SAβ-gal染色显示突变体中的细胞衰老（红色箭头），但wt。（C）每个肝脏的IHD细胞数（重量和重量）jag1b/2b型突变体。动物数量如图所示。（D）肝的相对大小、胆汁淤积玫瑰花结的数量以及wt和jag1b/2b型突变体。4个独立实验的存活率（n=80 wt；n=98个突变体）。（E）在发育中的对照肝脏中发现的IHD细胞（箭头）在72 hpf的Jagged1b/2b变体中不存在。IHD细胞（Alcama+/tp1GFP+/Prox1a+）、肝细胞（Hnf4a+/Bhmt+）。n在图中注明。（F） （顶部）蓝色斑点矩形描绘了活体斑马鱼肝脏（fabp10a:DsRed+）成像区域。（底部）在wt对照和Jagged1b/2b变体中用标记的IHD细胞（tp1:GFP+）从4-8dpf开始的相同肝脏的存活时间过程。红色箭头表示初始再生的IHD细胞。绿色虚线表示肝缘。（G）时间进程实验中对照组（n=4）和Jag1b/2b变体（n=5）肝脏中的IHD细胞数量。（H）受精后2个月的存活率（mpf）（n=80 wt；n=79个变体）。（左）对照组和Jag1b/2b变体中的IHD细胞（Alcama+/tp1:GFP+）在6 dpf下接受LY411575处理，在8 dpf下洗脱LY411515。(M（M）)IHD细胞数量的量化L（左）6 dpf和8 dpf。比例尺，50μm。ND：未检测到。
图2。
图2肝外胆管为肝内胆管再生提供多能干祖细胞。
（A、B）对照组和Jag1b/2b变体在3.5dpf时的EHD和近端肝脏的共聚焦图像。最早再生的IHD细胞（白色箭头；krt18a:GFP+/tp1:dsRed+/Alcama+/tp1:GFP+）与EHD相关。（C）3.5 dpf时，位于EHD 200μm范围内的IHD细胞百分比。检查的动物数量如图所示。（D）用胚胎标记EHD细胞的血统追踪策略ptf1a:Cre公司应急响应2、sw2mCh和Ptf1a MO，在24-48 hpf剂量下服用三苯氧胺。（E） （左）实验中发现的EHD和近端肝脏D类在4 dpf时，EHD（约10%标记的EHD细胞，n=7）和GB（高Anxa4+）中出现谱系标记细胞（mCherry+），但如图所示，肝脏（Bhmt+肝细胞）中没有（右）。（F）转基因ptf1a:Cre公司应急响应2/2米/小时/第1部分：GFP6 dpf的肝脏，含或不含Ptf1a和Jag1b/2b MO。mCherry+/tp1:带有Ptf1a MO的Jag1b/2b变体的肝脏中的GFP+IHD细胞（白色箭头）。tp1:同一肝脏中的绿色荧光蛋白−/mCherry+细胞（黄色箭头）较大且呈圆形，表明存在肝细胞。P： 胰腺；GB：胆囊；黄色虚线表示肝缘。mCherry+/tp1:在含有Ptf1a MO的Jag1b/2b变体中约13%（n=7/55）的肝脏中检测到GFP+IHD细胞，但在仅含有Ptf1a MO的对照斑马鱼的肝脏中未检测到（n=0/14个分析的肝脏数量）。在含有（n=7）和不含（n=8）Ptf1a-MO的肝脏中，再生IHD的细胞总数没有显著差异（p=0.46）。（G、H）在5 dpf的Jag1b/2b变形肝中，血统追踪EHD细胞，表达tp1:GFP（白色箭头）或肝细胞标记物Bhmt(H（H）; 黄色箭头）。（I，J）用二甲基亚砜（对照组，n=11）或DAPT（10μM；n=6）追踪治疗EHD细胞的Jag1b/2b变体的肝脏，显示肝脏中的追踪细胞（mCherry+）在对照组中可以是tp1:GFP+（白色箭头），在GSI治疗组中只有tp1:GFP-（黄色箭头）。比例尺，50μm。
图3。
图3：IHD细胞主要从Jag1b/2b变体中的EHD细胞再生，但肝细胞转分化在jag2b−/−突变体。
（A） （左）使用血统追踪策略标记EHD细胞和肝细胞sox17:Cre标准应急响应2具有2米/小时在Jag1b/2b变体中，以8-24 hpf的剂量服用三苯氧胺，（右）如图所示。（B）在再生tp1:GFP+IHD细胞出现之前，3 dpf（n=8）的Jag1b/2b变形肝脏显示有效的mCherry+标记EHD细胞（约27%）和肝细胞（约46%），而在6.5 dpf（n=18）的变形肝脏显示mCherry+标记再生IHD细胞（白色箭头；显示标记IHD的细胞百分比）。虚线框中的区域在右侧面板中被放大。（C） （左）使用血统追踪策略对肝细胞进行基因标记工厂10a:Cre应急响应2具有2米/小时在Jag1b/2b变体中，以24-48 hpf的剂量服用三苯氧胺，（右）如图所示。（D）3 dpf（n=22）时的Jag1b/2b变形肝脏显示再生tp1:GFP+IHD细胞出现前肝细胞广泛的mCherry+标记（约88%），6.5 dpf（n=120）时，再生IHD细胞核无mCherry+标记。(E、 F）（E）重量和jag2b−/−8 dpf时的突变肝脏显示肝细胞标记物Hnf4a和IHD标记物tp1:GFP/Alcama在wt肝脏中互斥表达，而tp1:GFP+/Hnf4a+双阳性细胞（白色箭头）在wt肝中发现jag2b−/−肝脏（n=5/21）(F类)，放大方框区域。（G，H）（G）重量控制和jag2b−/−8dpf突变肝脏与肝细胞谱系的追踪工厂10a:CreERt2型显示wt对照组肝脏中所有谱系标记（mCherry+）肝细胞缺乏tp1:GFP表达，而jag2b−/−在低频（n=2/37）下发现突变肝脏，双阳性tp1:GFP+/mCherry+细胞（白色箭头），呈胆管细胞样细胞形状（H）.比例尺，50μm。
图4。
图4肝外导管细胞为再生肝脏提供增殖祖细胞。
（A-D）（A）EdU掺入实验用于评估细胞增殖（4-5 dpf）。（B）5 dpf时对照组和Jag1b/2b变体EHD中的EdU+EHD细胞（黄色箭头）。用黄色虚线勾勒出EHD边距。（C）EdU+EHD细胞的百分比(D类)5 dpf时对照组和Jag1b/2b变体中的EHD细胞总数。所检查的动物数量已显示。（E，F）（E，顶部）在指定的时间点，在Jag1b/2b变体中对EdU治疗进行脉冲处理3小时。（E，底部）在3 dpf（n=7）、4 dpf（n=7），6 dpf（n=9）和7 dpf（n=10）条件下，EHD和Jag1b/2b变体的再生IHD中的EdU+EHD细胞（青色箭头）。（F）指定阶段Jag1b/2b变体EHD或IHD中EdU+细胞的数量。（G）总结Jag1b/2b变体正常IHD发育与IHD再生期间增殖模式的模型。在发育过程中，EHD细胞的增殖较低，分散在IHD中，而在再生过程中，最初EHD细胞增殖以向肝脏提供祖细胞。这些祖细胞随后在肝脏中分化为IHD细胞，并继续增殖，在最远端的IHD细胞中更为强劲。（H，I）肝脏重量和jag2b−/−6 dpf处的突变体显示肝淤胆玫瑰花结（洋红色箭头），通过卵磷脂染色（白色簇）在无tp1:GFP+IHD细胞的突变体肝脏区域显示，但在wt中未显示(我)已量化。（J、K）重量和重量的EHD中的EdU+细胞jag2b−/−6 dpf的突变体（经过8小时EdU治疗）显示扩大的突变体EHD（黄色箭头）中细胞增殖增加(K（K）)定量（n=肝脏数量）。比例尺，50μm。
图5。
图5.成年小鼠肝外导管细胞具有明显高的干/祖细胞基因表达和增殖潜力。
（A）图示8周龄C57BL/6小鼠肝外导管区域（洋红色虚线）和肝左叶（II；蓝色虚线）。通过MACS使用（EpCAM）微球分离EpCAM+EHD细胞（EHD）、EpCAM+IHD细胞（IHD）和EpCAM-肝细胞（LC）（参见补充图5）。右叶（rl）、中叶（ml）、尾状叶（cl）和胆囊（GB）。（B）热图显示了EpCAM+EHD和IHD之间共享的胆道标记基因，但没有显示EpCAM-LCs（log10标度条）。（C）基于原发性EHD、IHD和LC之间所有显著差异表达基因的无监督聚类分析，利用欧几里德距离对热图进行聚类，显示EpCAM+EHD和IHD之间的转录组差异大于EpCAM-LCs。（D）热图显示EHD中与IHD和LC相关的干/祖细胞/静止相关基因（见补充方法）的表达显著高于IHD（log10标度栏）。（E）端粒Q-FISH在新分离的EHD细胞与IHD细胞的细胞核（DAPI）中持续显示更强的信号（绿色；黄色箭头）。（F）EHD和IHD细胞中端粒标记颗粒荧光强度的定量。（G）EHD和IHD第一代（P1）类有机物的亮场和荧光显微镜显示一些较大的EHD衍生类有机物（品红色箭头）。Sox9和Ck7的表达证实了胆管细胞的身份。暴露2小时EdU后，EHD衍生有机物中的EdU+细胞增多。（H）前3代EHD和IHD中类有机物的平均直径（dia）。（一）EHD和IHD类器官（传代1）中EdU+细胞的比例。标尺，20μm（E），100微米（G）.
图6。
图6 Fgf信号通过阻止祖细胞过早分化和分配到肝脏，直接维持EHD生态位中的祖细胞。
（A）3 dpf（n=9）时，重斑马鱼EHD周围的致密间充质细胞（Isl1+）。hnf1ba：EGFP+前肠内胚层，显示EHD和肝脏、胰腺（P）和胆囊（GB）。(B）荧光就地杂交（FISH）显示高fgf10a型野生斑马鱼在3 dpf（n=5）时EHD周围的表达。（C）3 dpf时的EHD（Anxa4+）显示Prox1a和Hnf4a（插图；黄色箭头）在fgf10a−/−突变体，但wt中没有（n=16）。（D） （顶部）DMSO控制和FGFR抑制剂SU5402给药实验的时间表。（底部）用DMSO（左）或SU5402（右；2μM）以4-6 dpf处理6 dpf时的pan-Cdh+EHD（黄色虚线），显示SU5402处理后EHD中的异位表达IHD标记物（tp1:GFP和Alcama；黄色箭头）（n=7）。（E）模型描述了Fgf10a配体从间充质细胞直接向邻近EHD细胞发出信号，以抑制向肝细胞命运的分化。（F）利用抑制的Fgf受体信号标记内皮细胞克隆的世系追踪策略sox17:Cre标准应急响应2和热休克诱导Cre应答器hs:开关2dnFGFR.（G）在三苯氧胺治疗和热休克2小时后，4 dpf时，EHD（黄色箭头）、肝脏和胰腺（P）中出现dnFGFR1-EGFP+细胞克隆。EHD和GB的轮廓为红色。（H）三苯氧胺（8-24 hpf）和EdU（4-4.5 dpf）处理，热休克2小时（对照组）或12小时（4-4.5 dpf）诱导dnFGFR1-EGFP表达。（一）dnFGFR1-EGFP+克隆在热休克2或12小时后，EHD区域（方框内）放大并用紫色虚线勾勒。热休克2小时后，在所有EHD（n=15/15）中发现dnFGFR1-EGFP+细胞（绿色膜；黄色箭头），但在热休克12小时后在EHD（n=0/16）中未检测到。（J）EHD中的EdU+细胞（用黄色虚线勾勒出）受到2小时或12小时的热休克，显示在长时间热休克后EdU+EHD细胞增加。12小时EdU治疗。（K）dnFGFR1-EGFP热休克诱导2hr（n=8）和12hr（n=12）后的EdU+EHD细胞数量。（左）使用血统追踪策略标记EHD中Fgf受体信号受抑制但肝脏中不受抑制的细胞克隆ptf1a:Cre公司应急响应2、Ptf1a MO和hs：开关2dnFGFR如图所示。（M） （顶部）在24-48 hpf下暴露三苯氧胺，然后在5 dpf下热休克诱导dnFGFR1-EGFP 2小时（对照组）或12小时。（底部）热休克2小时（n=9）后，在EHD中发现dnFGFR1-EGFP+克隆（绿色；黄色箭头），但热休克12小时（n=12）后位于肝脏中。（N）热休克2小时（n=9）和12小时（n=12）后dnFGFR1-EGFP+细胞的肝脏百分比。比例尺，50μm。
图7。
图7 Fgf信号的化学抑制刺激EHD细胞分配到肝脏并加速IHD细胞再生。
（A） （顶部）使用的EHD谱系追踪方法ptf1a:Cre公司应急响应2、sw2mCh和Ptf1a MO，在3 dpf下短暂暴露于DMSO或SU5402（2μM）8小时，并在4.5 dpf下进行分析。（底部）血统追踪EHD细胞（mCherry+）在DMSO处理的对照组中仅限于EHD（n=0/18），但在SU5402处理后出现在肝脏（黄色箭头）（n=6/21）。(B类)（顶部）用二甲基亚砜或SU5402在3 dpf下处理Jag1b/2b变体8小时，并在6 dpf下进行分析。（底部）二甲基亚砜或SU5402治疗后，以6 dpf在Jag1b/2b变体的整个肝脏中再生IHD（tp1:GFP+/Alcama+）。（C）经二甲基亚砜或SU5402处理（8小时；0.5μM和2μM）的Jag1b/2b变体中再生的IHD细胞数量。（D）野生斑马鱼IHD发育的工作模型爪1b/2b突变体和EHD介导的Jag1b/2b变体中IHD细胞的再生。比例尺，50μm。
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