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.2021年9月：103-104:1-21日。
doi:10.1016/j.matbio.2021.09.001。 Epub 2021年9月17日。

整合素黏附内的EphA2信号调节纤维黏附延长和纤维连接蛋白沉积

亚历山德拉·C·芬尼 1, 马修·斯科特 2, 凯莉娅·李维斯 2, 王东东 2, 马布鲁卡·阿尔法迪 2, 杰克·施瓦茨 1, 康纳·M·奇蒙 1, 克里斯蒂娜·阿科斯塔 1, 詹姆斯·墨菲 三, J史蒂文·亚历山大 4, 克里斯托弗·巴蒂略 4, Ssang-Taek Lim公司 三, 韦恩·奥尔 5
附属公司

整合素黏附内的EphA2信号调节纤维黏附延长和纤维连接蛋白沉积

亚历山德拉·C·芬尼等。 基质生物. 2021年9月.

摘要

多功能糖蛋白纤维连接蛋白影响几个关键的细胞过程，并有助于多种病理。虽然纤维连接蛋白相关病理与受体酪氨酸激酶EphA2之间存在联系，但EphA2促进纤维连接蛋白基质重塑的机制尚不清楚。我们之前证明，EphA2缺失可减少动脉粥样硬化中平滑肌纤维连接蛋白的沉积并钝化纤维连接到蛋白的沉积，而不影响纤维连连接蛋白表达。我们现在表明，EphA2的表达是收缩性依赖的张力蛋白和α5β1整合素丰富的纤维粘连的伸长所必需的，这些纤维粘连驱动纤维连接蛋白纤维生成。从机制上讲，EphA2定位于整合素黏附，其中粘着斑激酶介导配体诱导的依赖性Y772磷酸化，该位点的突变显著降低了纤维黏附长度。EphA2缺乏通过增强p190RhoGAP激活和降低RhoA活性来降低平滑肌细胞的收缩力，而刺激EphA2缺陷细胞中的RhoA信号可以挽救纤维粘附延长。总之，这些数据确定了EphA2是一种新的纤维粘附伸长调节器，并提供了第一个确定EphA2信号在整合素粘附中的作用的数据。

关键词：EphA2受体酪氨酸激酶；纤维粘连；纤维结合蛋白沉积；粘着斑激酶；P190RhoGAP；RhoA收缩性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益声明：没有。

数字

图1：
图1:。EphA2缺失降低了张力蛋白定位和纤维粘附长度。
用靶向EphA2的模拟或siRNA转染人血管平滑肌细胞（VSMC）24小时。A-C）细胞在1%血清中放置于Matrigel-coated玻片上过夜，并进行整合素粘附分离。蛋白表达通过免疫印迹测定并归一化为整合素连接激酶（ILK）。来自全细胞裂解物（WCL）组分的β-微管蛋白用于整合素粘附分离纯度。B、 C）定量来自整合素粘附分数的张力蛋白和α5整合素。D） 对细胞进行张力染色。E、 F）对细胞进行活性β1整合素（12G10）染色，并以微米为单位量化粘附长度。G、 H）对细胞进行活性α5整合素（SNAKA51）染色，并以微米为单位量化粘附长度。（一） 对β1和张力蛋白相互作用进行邻近连接分析（PLA），并用DAPI（粉红色）进行复染。比例尺=25μm。J） 对每个高功率场的PLA点状物进行量化，并将其标准化为每个高功率场的DAPI数量。比例尺=25um。n=3-4。数据表示为平均值±SEM。使用Student的T检验（B、F、H、J、L）进行统计比较。p值小于0.05被视为显著。
图2：
图2:。血清治疗诱导配体依赖性EphA2磷酸化。
用靶向EphA2的模拟或siRNA转染人VSMCs 24小时。细胞在无血清或1%血清中放置于Matrigel涂层板上过夜。通过免疫印迹（A）代表性免疫印迹和（B）磷酸化Y772、磷酸化S897和总EphA2的密度测定分析分离并分析蛋白质。总EphA2标准化为GAPDH，pEphA2 Y772和pEphA2S897标准化为总EphA2。值表示为相对于基线的折叠变化（模拟0'）。C） 将人VSMC缺血清4小时，用1μg/mL Fc-EphrinA1处理5或30分钟，然后进行磷酸化（Y588、Y772和S897）和总EphA2的免疫印迹。D-E）将人VSMC接种到Matrigel-coated玻璃盖玻片上，在含1%血清的培养基中过夜，并对（D）S897-磷酸化EphA2（teal）、（E）Y772-磷酸化EphaA2（tear）、（D，E）Y397-磷酸化FAK（红色）和DAPI（细胞核）进行染色。F） 将细胞放置在1%血清中的Matrigel-coated玻片上过夜，然后进行整合素粘附分离，并通过免疫印迹检测蛋白表达。G） 用EphA2-WT、K646M或R103E转染EphA2 KO小鼠主动脉VSMCs细胞，在1%血清中放置过夜，并对磷酸化EphA2 Y772（茶色）、Y397-pFAK（粉红色）、EphA2（白色）和DAPI（细胞核）进行染色。n=4。数据表示为平均值±SEM。使用双向方差分析和Bonferroni后验进行统计比较。p值小于0.05被视为显著。
图3：
图3:。依赖EphA2-的纤维粘附伸长需要Y772磷酸化，而不是EphA2-ligand相互作用。
用模拟、EphA2-WT、（A-D）EphA2-Y772F或（E-H）EphA2-R103E构建物转染EphA2 KO小鼠主动脉VSMC 24小时，然后在1%血清中隔夜将其涂布在Matrigel-coated盖玻片上。对细胞进行EphA2染色（白色），并对EphA2阳性细胞进行定量。A-B，E-F）细胞被fortensin（teal）染色，粘附长度以微米为单位进行测量。C-D，G-H）细胞染色以检测纤维连接蛋白（teal），并量化为纤维连连接蛋白阳性区域（单位：微米）。比例尺=25μm。n＝4-5。数据表示为平均值±SEM。使用单向方差分析和Bonferroni后验进行统计比较。p值小于0.05被视为显著。
图4：
图4:。FAK是局部粘附内EphA2磷酸化所必需的。
用模拟或siRNA靶向FAK转染人VSMCs细胞24小时。然后将细胞放置在Matrigel上过夜，血清饥饿4小时，并在指定的时间点用1%的血清处理。A） 通过免疫印迹分析磷酸化EphA2，并将其归一化为总EphA2或（B）染色的Y772-Phospho-EphA2（teal）和DAPI（nucleus）。C） 用PF-573228（PF，4μM）处理细胞30分钟，然后在指定的时间点用1%的血清处理。通过免疫印迹分析磷酸EphA2并将其归一化为总EphA2。D） 将FAK-WT或FAK-KD细胞血清饥饿4小时，然后在指定的时间点用1%的血清处理。用免疫印迹法测定磷酸EphA2，并将其归一化为总EphA2。折叠更改与模拟/NT/WT 0'时间点相关。n=4。数据表示为平均值±SEM。使用双向方差分析和Bonferroni后验进行统计比较#比较每个治疗条件下的p值（模拟与siFAK）*p值使用Student的T检验比较基线（0'1%FBS）条件之间的差异。p值小于0.05被视为显著。
图5：
图5:。EphA2促进VSM细胞的收缩性，而不依赖于钙信号。
用靶向EphA2的模拟或siRNA转染人VSMC 24小时。A） 将细胞嵌入从鼠尾分离的0.8%胶原蛋白中，并在37°C下聚合。细胞和胶原蛋白凝胶在1%的血清中培养过夜，胶原蛋白凝胶直径被测量并表示为相对于微孔直径的收缩百分比。B、 C）将细胞放置在1%血清中的Matrigel上过夜，用B）Western blot测定磷酸化MLC，并用DAPI（细胞核）将其归一化为总MLC或C）染色（粉红色）。D-F）细胞在用1%血清治疗前45分钟用1μM Fluo4-AM标记。在15分钟内，每隔15秒通过显微镜观察一次Fluo4-AM荧光。D） 每个细胞的荧光强度（振幅，ΔF/F0）用直方图表示。E） 荧光强度的平均振幅显示为95%置信区间，虚线表示重叠的SEM。F）Fluo4-AM标记细胞的代表性图像。G） 将细胞放置在1%血清中的Matrigel上过夜，通过Rho活化试验测定RhoA活性。通过Western blot测定活性RhoA，并将其归一化为总RhoA。采用不可水解GTPγS作为阳性对照（（+）cont）。将瞬时表达EphA2-WT、EphA2-Y772F和EphA2-R103E的N=6（H-K）EphA2 KO小鼠VSMC接种在1%血清中的Matrigel上过夜，然后（H，J）染色：磷酸-MLC（粉红色）、EphA2（白色）和DAPI（细胞核），（l，K）量化为平均荧光强度（MFI）。比例尺=25um。n=4-7。数据表示为平均值±SEM。使用Student’s T检验（A，B，G）或双向方差分析与Bonferroni后验（I，K）进行统计比较。p值小于0.05被认为是显著的。
图6：
图6:。EphA2通过RhoA发出信号，促进纤维粘附伸长和纤维连接蛋白沉积。
A-D）EphA2 WT小鼠VSMCs用mock、RhoA WT或显性阴性RhoA（RhoA-N19）转染24小时。用模拟、RhoA-WT或组成活性RhoA（RhoA-Q63L）转染（E-H）EphA2 KO小鼠VSMC 24小时。细胞在转染后放置在Matrigel上过夜，并对GFP阳性细胞（白色）进行量化。A/B、E/F）细胞染色以检测张力蛋白（teal）、活性β1整合素（9eg7，粉红色）和DAPI（紫色），并以微米为单位测量纤维粘附长度。C/D，G/H）细胞染色以检测纤维连接蛋白（teal）和DAPI（紫色），并以微米为单位测量纤维连接蛋白面积。比例尺=25μm。n=4。数据表示为平均值±SEM。使用单因素方差分析（One-way ANOVA）与Bonferroni后测进行统计比较，p值小于0.05被认为是显著的。
图7：
图7:。EphA2的缺失增强p190Rho-GAP磷酸化以抑制纤维连接蛋白纤维生成。
A/B）将EphA2 WT或EphA2 KO小鼠VSMC在1%血清中放置于Matrigel上过夜，通过Western blot定量磷酸化p190RhoGAP，并将其归一化为总p190RhosGAP。C/D）将EphA2 WT小鼠VSMC在1%血清中的Matrigel上放置过夜，然后用ALW-II-41-27（0.5μM）处理30分钟。通过Western blot定量磷蛋白p190RhoGAP，并将其归一化为总p190RhosGAP。E-G）用针对p190Rho-GAP的模拟或siRNA转染EphA2 KO小鼠VSMC 24小时，然后将其涂布在Matrigel上过夜。G、 H）对细胞进行张力蛋白（teal）、活性β1整合素（9eg7，粉红色）和DAPI（紫色）染色，并以微米为单位测量纤维粘附长度。比例尺=25μm。n=4-5。G） 用脱氧胆酸提取液分析细胞的纤维连接蛋白沉积。脱氧胆酸不可溶（沉积）纤维连接蛋白归一化为脱氧胆汁酸可溶GAPDH。H/I）EphA2 WT或EphA2 KO小鼠VSMC在1%血清中放置于Matrigel上过夜，通过Western blot定量磷酸化-FAK Y397，并归一化为总FAK。数据表示为平均值±SEM。使用Student的T检验进行统计比较。p值小于0.05被视为显著。
图8：
图8:。拟议信号通路示意图：
EphA2调节纤维连接蛋白沉积的拟议机制的示意性总结。1） 局灶粘附中的EphA2通过局灶粘附激酶（FAK）对Y772进行配体诱导的磷酸化。EphA2的表达限制了FAK的活性，这表明FAK和EphA2信号在局部粘附中存在一种新的相互关系。2） 升高的EphA2信号和降低的FAK信号与p190RhoGAP的磷酸化和活化降低有关。3） 无活性p190RhoGAP引起的RhoA活性升高介导肌球蛋白轻链磷酸化和细胞收缩性。4） RhoA驱动的收缩性支持α5β1整合素在富含张力蛋白的纤维粘连中的募集，从而驱动纤维连接蛋白沉积。
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