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.2022;13（1）:309-337.e3。
doi:10.1016/j.jcmgh.2021.08.016。 Epub 2021年9月9日。

小鼠近端、中部和远端结肠的独特神经回路连通性定义了区域结肠运动模式

安德烈亚·内斯托尔·卡利诺斯基 1, Kristen M Smith-Edwards公司 2, 金伯利·米尔夏特 2, 约瑟夫·马吉奥塔 三, 巴特克·拉杰瓦 4, 布莱恩·戴维斯 2, 马特·霍华德 5
附属公司

小鼠近端、中部和远端结肠的独特神经回路连通性定义了区域结肠运动模式

安德烈亚·内斯托尔·卡利诺斯基等。 细胞分子胃肠肝素. 2022.

摘要

背景和目标：结肠运动模式已被许多不同的群体描述，但支持模式运动活动的神经连接和神经节结构尚未阐明。我们的目标是按区域定量描述小鼠肠道神经系统的结构结构，并使用功能性钙成像、药理学和电刺激来显示不同运动模式的区域基础。

方法：用表达钙指示剂GCaMP6f或GCaMP6的小鼠的切除结肠段检测GCaMP-介导荧光的自发和诱发（药理学或电学）变化，并结合结肠运动活性评估、免疫组织化学和共焦成像。采用三维图像重建和统计方法定量描述小鼠结肠肌间神经节结构、神经和血管网络模式以及神经连接。

结果：在完整结肠中，区域特异性肌间神经节的大小、结构、神经回路连接模式以及神经递质受体的表达是结肠运动模式的基础，定义了结肠的功能差异。自发、诱发和化学诱导神经活动的区域特异性效应有助于区域运动模式，神经节内功能连接也是如此。我们提供了神经回路结构和功能区域差异的直接证据，这些差异仅在以前的研究中推断出来。我们对小鼠和人类结肠的定量测量值进行了区域比较，这代表着在显示小鼠系统对人类结肠翻译的有用性和相关性方面取得了重要进展。

结论：有几种神经机制依赖于肌间神经节结构和功能连通性，它们是小鼠结肠模式运动功能神经原性控制的基础。

关键词：结肠肠神经系统；功能神经电路；胃肠道；定量形态学。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
肌间神经元面积、体积和神经节体积。(A1类和A2级)人工测量了来自3只野生型和9只ChAT报告小鼠的1121个神经元（372个近端、374个中端和375个远端）的横截面积，免疫染色用于泛神经标记物HuC/D和识别神经丝、钙结合蛋白、钙网蛋白、GABA和NOS的抗体组合。神经元体积(B1和地下二层)在与面板相同的神经元中测量一个; 3例患者的神经元体积没有差异（图2B1–B3层)结肠区域，但与远端结肠相比，近端结肠和中间结肠的面积有显著差异(A2级). 统计数据（单因素方差分析）表明，与远端结肠相比，近端结肠和中段结肠的横截面积存在微小但显著的差异，这可能是由于数据集中包含的神经元数量所致。由于比较神经元体积时没有差异，并且基于平均神经元面积的任何区域都没有差异，因此我们得出结论，细胞大小没有区域差异。(C类)根据制造商的方案，使用Imaris软件（英国贝尔法斯特Bitplane）测量免疫标记神经元标记物HuC/D的ChAT或NOS报告小鼠的神经节容积；(C1类)近端结肠（图2第2页)、和(指挥与控制)远端结肠（图2D7日).
图2
图2
结肠绘图解剖的位置和大小。(一个)清洁并固定结肠，显示整个结肠长度。结肠长度从68毫米到79毫米不等(B–D类)结肠被解剖成所示的大小和位置，以保持定量测量的一致性。每个冒号块在每个方框的右上角进行编号。这些数字用于识别每个后续图中适当的样本来源。每个方案从同一近端结肠口腔部位开始编号。每组以数字1开头，因为它表示所有3个分段方案都从同一位置开始，并显示每个方案中的分段数。方案中的长截面B类包括方案中的数字1和2C类以及方案中的数字1、2和3D类.方案中的子部分C类和D类是方案中显示的总区域的较小部分B类.在方案中C类，方案中的第1部分B类分为2个部分，在方案中D类，共分为三部分。
图3
图3
肠系膜神经元数量。(一个)在结肠的9个区域计算每个神经节的神经元数量（图2D1–D9)对ChAT报告小鼠进行HuC/D和钙结合蛋白、钙视网膜蛋白或NOS免疫染色。每个区域至少有50个神经节。(一个)使用单因素方差分析和Tukey多重比较检验对数据进行分析。*P（P）< .05, ∗∗∗P（P）< .001. 过渡区各地区之间没有显著差异。插入：近端神经节大小（图2第2页)，中间（图2D5型)和远端结肠（图2D8日)在野生型报告小鼠中。(B类)作为单个孤立细胞出现的神经元数量(B1和地下二层)，双人床(B1和B4类)，或3-5组(B1和B5公司)，在近端计数（图2B1)中间（图2地下二层)和远端结肠（图2B3层)用增强的绿色荧光蛋白或TdTomato、钙结合蛋白或钙结合蛋白和HuC/D特异性抗体进行免疫标记的样品(B1)显示近端、中部和远端结肠的神经元百分比；这个条形图符号在图中定义。比例尺：100微米(一个，插图）和50μm(B2–B5).
图4
图4
结肠形态学：定量和描述性。(一个)使用Leica系列工具在共聚焦投影上手动测量肌间神经节之间的纵向和周向距离，每个区域有3个样本（图2D类，所有区域）和每个方向上的123个测量值。(B类)用手测量4个近端样本的节间面积（图2B1)，中间（图2地下二层)和远端（图2地下三层)结肠共焦投影，每个区域至少609个测量值。(B1–B3层)量化的图像示例。(C类)整体安装(C1类)近端共焦图像（图2B1)来自Wnt YFP报告小鼠的结肠显示带束性和节间区(白色括号). (指挥与控制)近端结肠来自C1类沿着肠系膜边界切开，测量了中层带的宽度，如图所示(白色括号). (C3类和补体第四成份)肌间神经节向陆间带区域变小。(C5级和C6级)近端结肠（图2指挥与控制)蛋白基因产物9.5（PgP9.5）和电离钙结合分子1（IBA1）的免疫标记在肌间神经细胞中显示免疫标记(箭头). (C6级)跨行政带区域的共标记神经元（PgP9.5、TuJ1、IBA1）(箭头).比例尺：100微米(B1)，150微米(地下二层)，100微米(地下三层)，200微米(C3类)，100微米(补体第四成份)和50μm(C5级).
图5
图5
肌间神经丛定量测量：小鼠与人类的比较。小鼠近端、中段和远端结肠与人类结肠测量值的比较。(一个)使用阈值法在ImageJ的共焦图像堆栈上测量肌间神经节的面积和体积。此前公布了人体样本的数据。右结肠，也称为升结肠，是结肠的起始部分，相当于小鼠近端结肠。左结肠或降结肠始于脾曲，止于乙状结肠，相当于小鼠远端结肠。表中使用的术语（右冒号和左冒号）与我们的原始文章中使用的相同，为了清晰起见，对其进行了维护。小鼠近端结肠中的神经节区域最接近人类右侧结肠。人类神经节的整体堆积最好以小鼠中结肠为模型。与人类相比，老鼠每平方毫米的神经元数量明显更多。(一个和B类)为了测量小鼠的神经节面积和体积(B–D类)用手勾画神经节轮廓，然后自动计算面积和体积测量值。(C类)示例显示阈值样本中以黄色勾勒出的肌间神经丛。(D类)用于神经节面积测量的肌间神经节周围感兴趣区域的示例。所有测量均在结肠组织上进行，如图2所示B1–B3层. (C类和D类)比例尺：50微米。
图6
图6
量化观察到的ENS网络架构的组织。一个典型的示例(一个和B类)二值化网络(B类)定向分析图像，以及(C类)显示顶点价的提取图。(D类)计算出的取向分布显示了2个主要方向（0和π/2）。结肠区域如图2所示地下二层和2地下三层. (一个)比例尺：100微米。
图7
图7
生长抑素影响自发和诱导的肌间神经活动。生长抑素（0.65–1.00μmol/L）强烈抑制自发Ca2+聊天中DMPP的瞬态和响应+/GCaMP6f+结肠肌间神经细胞。(一个和B类)3D图显示生长抑素强烈抑制自发钙的频率2+从ChAT记录的瞬态+/GCaMP6f+结肠肌间神经细胞对振幅或动力学（上升和下降时间）没有明显影响。钙2+图中显示了12个神经元同时记录1800次的瞬态(一个)在和之前(B类)应用生长抑素20分钟后。(C类和D类)生长抑素抑制DMPP诱发的钙2+聊天记录的回复+/GCaMP6f+结肠肌间神经细胞。显示了10个神经元通过快速吞吐灌注DMPP所诱发的同步反应(C类)在和之前(B类)沐浴后20分钟施用生长抑素。(E类)生长抑素使DMPP的反应降低50%。钙2+在50个对照神经元和45个接受生长抑素治疗的神经元（N=3）中测量瞬态。在近端结肠的30个对照（+DMPP）和30个治疗（DMPP+生长抑素）神经元（N=2）中测量诱导活性（图2B1).
图8
图8
肠系膜神经元的特性和形态。(A–C)表达CGRPA的神经元（图2B1)近端和（图2地下二层)中间结肠（图2地下三层)远端结肠几乎没有。结肠远端的CGRPA纤维可能来源于外源性背根神经节传入。(第1天)CGRPA神经元表达(第3天)钙结合蛋白(D1–D4)IPAN和(第1天和第4章)用CGRP特异性抗体标记CGRPA和CGRPB神经元。(E–H（E–H）)CGRPA轴突是(E类和F类)大部分光滑，但在神经节内和周围分叉的(F类)静脉曲张。(G公司)由与突触素标记（定位突触）终端相关的CGRPA纤维网络包围的神经元簇。(H（H）)肌间神经细胞周围的一些CGRPA终末表现为修饰花萼。(I1类和I2类)钙结合蛋白在表达ChAT（可能是IPANS）和(J1–J3号机组)其中一些不表达ChAT，但表达P物质；这个神经元的身份未知。物质P也在ChAT+钙结合蛋白表达神经元（可能是IPANS或兴奋性运动神经元）和不表达ChAT的神经元周围形成密集的篮状结构。这个神经元的身份尚不清楚，但篮子结构可能来自IPAN。(K–O型)CGRPA神经元形态；(L（左）)多吉尔II型(米)具有单一过程的腺苷酸，以及(K（K）)神经元有板层树突，但有1个以上突起。(N个和O（运行）)丝状酪氨酸受体激酶B（TrkB）报告神经元纤维运行(N个)纵向和(O（运行）)沿圆周方向。(D–O型)结肠区域的样本B1–B4层（图2）。比例尺：100μm(A–C)，50微米(D1–K)和25μm(L–O型).
图9
图9
从结肠近端到远端，肌间神经节连接模式发生变化。(A1–A3)显示近端肌间神经节合胞模式的示例（图2C1类和指挥与控制)vs中间的图案（图2C3类和补体第四成份)和远端（图2C5级和C6级)冒号。黄色感兴趣区域勾勒出每个区域中的几个神经节。图片是共焦图像堆栈投影的快照。(B1–B3层)在近端结肠中，神经节间和神经节内连接的分支模式（概述为白色V字形)似乎特定于此区域。(地下三层)在近端结肠有明显的纵向(白色箭头)和圆周(绿色曲线箭头)连接性。(地下三层)篮子结构(白色盒子)很明显。(C1-C3型)在中结肠(第1天)节间链之间的连接增加(白色箭头和双箭头)经常绕过神经节(白色箭头在里面C1类). (D1–D3)远端结肠的连接模式越来越复杂，1个神经节的多个突起汇聚在单个神经节上(支架在里面第3天). 小三角形神经节常形成连接点的间隙(圈子在里面C1类和三角形在里面第1天和第3天). 注意，出现白色的细胞共表达ChAT、CalB和CalR。(地下二层)可见ChAT细胞体的相对缺乏是由于样品的不均匀性，而不是缺少ChAT表达神经元。比例尺：100微米(A1–C3)，50微米(D1–D3). 钙结合蛋白；钙黄体生成素。
图10
图10
神经节内连接和突触部位的3D重建。(A1类)神经节内连接根据(A1类)共焦成像和(A2级)使用Imaris进行3D重建（英国贝尔法斯特Bitplane）。图2中显示的神经节来自结肠区域第4章显示了3个神经元的局部细胞-细胞接触(箭头). 1号电池接触紧密(橙色球)带有4个单元格。2号电池有4个闭合触点(黄色的球)3号细胞与3个神经元有密切接触，至少1个神经元有多个位点(橙色的球). 每个细胞都表达钙结合蛋白和ChAT，表明它们是IPAN。突触前标记物突触素的免疫标记证实了突触的存在(地下三层和B4类). (B1)CGRPA神经元有明显的静脉曲张(地下二层)突触素接触次数可变(地下三层和B4类)在他们的躯体和轴突上。(B1–B4层)图像来自近端结肠区域D4（图2）。比例尺：50μm(A1类和A2级)和25μm(B1–B4层).
图11
图11
表达nACh受体和/或5-HT-3受体的肌间神经细胞的差异分布。(一个)近端反应曲线的图形摘要（图2B1)，中间（图2地下二层)和远端（图2地下三层)总反应神经元的结肠。图中显示了仅对5-HT（5-HT特异性，深蓝色）、仅对DMPP（DMPP特异性，浅蓝色）或对这两种激动剂（both，紫色）作出反应的神经元的百分比。(B类)视野中总神经元近端、中部和远端结肠的反应模式的图形总结。图表显示了仅对5-HT（5-HT特异性，深蓝色）、仅对DMPP（DMPP特异性，浅蓝色）、对两种激动剂（both，紫色）或对两种都不激动剂（None，绿色）作出反应的神经元的百分比。对于每个视角，收集了三部20年代的电影；首先对自发活动进行成像，然后在使用5-HT（10μmol/L，H9523；Sigma）和DMPP（10μmol/L，D5891；Sigma2）的过程中，通过直接放置在物镜两侧成像场上方和附近的2个玻璃吸管进行成像。使用染料进行的初步研究证实，含量达到了整个视野。将激动剂的使用顺序以及结肠区域随机分配，在使用第二种激动剂之前，将第一种激动剂冲洗10分钟。通过计算dF/F分析GCaMP6s信号的振幅0（%=[（F-F0)/F类0]×100），其中F为荧光峰值，F0是使用激动剂前的平均荧光；自由/自由0大于基线的四个标准偏差中的一个被视为响应。只有在所有3个成像场中发现的神经元被纳入分析。*P（P）<.05，***P（P）<.01和***P（P）<.001，使用重复测量双向方差分析。n=3只小鼠的n=4-6个区域。（A） 近端结肠的数据以不同的形式出现在其他地方（见Margiotta等人44).
图12
图12
与远端结肠相比，神经回路在近端结肠支持CMC活性方面存在差异。(一个)使用ImageJ插件模板匹配测量的环形（x，蓝色）和纵向（y，绿色）肌肉轴中的组织位移轨迹示例显示了定期发生的CMC。(Bi公司)组织移位痕迹（蓝色）和平均GCaMP6s+整个视野（黑色）的信号显示肌间神经活动的协同增加或总和(粉红色星号和箱)在CMC之前。(Bii公司和比尔)15秒神经活动的时间-彩色编码图像(ii（ii）,左边)在和之前(三,正确的)CMC之后。请注意，在CMC（以洋红色表示）之前，有许多神经元同时显示出最大活动。(C类)GCaMP6+近端结肠自发活动3分钟记录的痕迹(顶部)导致CMC和远端结肠(底部)CMC没有定期发生。(D类)无论结肠位置如何，CMC试验中自发活动神经元的最大百分比更高(黑色圆圈)与不含CMC的试验相比(红色X). n=5只小鼠的近端结肠试验12次，远端结肠试验11次。(E类)近端结肠与远端结肠相比，具有神经原活性和相应CMC的试验百分比更高(P（P）<.001，N=5小鼠），表明近端结肠肌间神经细胞的活性协同增加的频率高于远端结肠。(F类)协调、总和神经活动的平均持续时间（秒）（由粉色盒子在面板中B类和C类)与远端结肠相比，近端结肠的长度更长。(G公司)时长彩色编码图像(顶部)和GCaMP6秒痕迹(中间的，品红色）近端结肠肌间神经细胞对电刺激的反应；成像场的位移轨迹(底部，蓝色；圆轴，绿色；纵轴）表明，神经活动的总和在记录结束时产生了类似CMC的事件。(H（H）)时长彩色编码图像(顶部)和GCaMP6+痕迹(中间的（深蓝色）远端结肠肌间神经细胞对电刺激的反应；成像场的位移轨迹(底部)表明诱发神经活动的模式不会导致CMC。注意近端结肠和远端结肠的总和差异。(我)散点图显示近端和远端结肠延迟反应和诱发组织位移的关系。(J型)近端结肠和远端结肠中早期反应神经元百分比的图形总结。(K（K）)近端结肠和远端结肠延迟反应神经元百分比的图形总结。在这些实验中使用了整个结肠长度。
图13
图13
结肠血管系统与整个结肠组织结构平行。(A–C)血管系统用番茄凝集素-Dylight 488绘制，共焦瓷砖扫描显示重复的血管模式起源于(一个)肠系膜动脉（MA）和静脉（MV）。(C类)使用内皮标记物CD31确认血管系统的模式。(D1–D4)大型和小型分行离开(第1天)肠系膜动脉(第2页)主要在(一层楼和地上二层)肌间神经丛浆膜侧(第3天)蜿蜒而过的毛细血管网(第4章)肌间神经节。(E1级)在表达钙调素的神经元周围观察到血管网(箭头)或未识别的神经元(V字形). 向上皮细胞方向，血管组织致密，大多位于下方(E2级)粘膜下神经节(E3公司)深度。对整个结肠进行评估。比例尺：200微米(一个和C类)，400微米(B类)，50微米(D1–E3)，200微米(一层楼和地上二层).
图14
图14
结肠粘膜下神经节的分布。在近端（N=177个神经节）、中部（N=163个神经节，远端（N=155个神经节。对于每个完整的结肠样本，定位肌肉的内环层，并将微米刻度设置为0，然后以微米步长穿过粘膜下层，测量遇到的每个神经节与环肌的距离。每个样品中至少测量了4个不同的区域。(A–C)数据根据距离进行分类，并显示每个分类单元的神经节数（频率）。(B类)与近端或远端结肠相比，中结肠粘膜下神经节更靠近内环肌。(D–F型)对于测量的每个区域，神经节之间的距离在接近上皮时增加。测量每个神经节的每个区域（近端、中部、远端）与内环肌的距离。数据显示，正如我们为人类发布的那样，神经节分布在粘膜下层。取样的近端结肠来自B1区，中结肠来自B2区，远端结肠来自B3区（图2B类).
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中的注释

  • 在肠神经系统中，一切都与连接有关。
    Avila JA，南密歇根州。 Avila JA等人。 细胞分子胃肠肝素。2022;13(1):346-347. doi:10.1016/j.jcmgh.2021.09.016。Epub 2021年10月16日。 细胞分子胃肠肝素。2022 PMID：34666010 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

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参考文献

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