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.2021:62:100115.
doi:10.1016/j.jlr.2021.100115。 Epub 2021年9月9日。

一种简单、快速、灵敏的基于荧光的评估三酰甘油水解酶活性的方法

苏吉思·拉詹 1, 黑兹尔·德古兹曼 2, 托马斯·帕里亚 1, 艾拉·J·戈德堡 三, 马哈茂德·侯赛因 4
附属公司

一种简单、快速、灵敏的基于荧光的三酰甘油水解酶活性评估方法

苏吉思·拉詹等。 脂质研究杂志. 2021.

摘要

脂肪酶是一类重要的水溶性酶，对疏水性三酰甘油（TAG）的水解进行催化。它们的酶活性通常使用多步骤程序进行测量，包括水解产物的分离和定量。我们在这里报道了一种新的荧光方法，可以实时测量脂肪酶的活性，而不需要将底物从产品中分离出来。我们以脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）和脂蛋白脂肪酶为模型脂肪酶，建立了这种方法。我们首先用含有硝基苯并恶二唑（NBD）标记的TAG的底物囊泡培养ATGL或LpL源，然后测量NBD荧光的增加，并计算酶活性。将NBD-TAG并入磷脂酰胆碱（PC）囊泡中会导致一些水解；然而，在这些NBD-TAG/PC囊泡中加入磷脂酰肌醇，并增加NBD-TAG与PC的比率，可大大促进底物水解。该测定法也可用于测定胰脂肪酶和激素敏感脂肪酶的活性。接下来，我们测试了几种小分子脂肪酶抑制剂，发现奥利司他抑制所有脂肪酶，表明它是一种泛酶抑制剂。简而言之，我们描述了一种简单、快速、基于荧光的三酰甘油水解试验，以评估四种主要的TAG水解酶：细胞内ATGL和激素敏感性脂肪酶、定位于细胞外内皮的LpL和肠腔中的胰腺脂肪酶。这种方法的主要优点是速度快、简单，并且消除了产品隔离。该分析可能适用于广泛的脂肪酶，适合高通量筛选，以发现三酰甘油水解酶的新调节剂，并可用于诊断目的。

关键词：ATGL；NBD-标签；酶活性；高通量筛选；激素敏感脂肪酶；脂质；脂肪分解；脂蛋白脂肪酶；奥利司他；三酰甘油。

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数字

图1
图1
NBD-C6与NBD-TAG的分离。A： 将不同量的NBD-C6（n=4）和NBD-TAG（n=4）分别在37°C的缓冲液K中孵育1小时，并按照材料和方法中所述进行脂质提取。测量水相顶部的NBD荧光。B： 将不同数量的NBD-C6（n=3）与固定数量的NBD TAG（1250 pmol）混合，并在37°C的缓冲液K中培养1 h。脂质提取后测定水相NBD荧光。四个独立实验的数据代表。
图2
图2
NBD-TAG的hATGL蛋白依赖性水解。A： 用表达His-tagged human ATGL（hATGL）的质粒pcDNA3或pcDNA3-转染Cos-7细胞三次。按照方法所述，收集细胞并在缓冲液K中均质。细胞裂解物（20μg蛋白质）在凝胶上分离，并用抗-His抗体（左）和肌动蛋白（右）进行探测。B： 将不同数量的细胞裂解物蛋白与NBD-TAG（10μl，880 pmol）在PC囊泡中孵育1 h。在脂质提取之后测量水相中的荧光。如图1所示，使用标准曲线量化NBD-C6的量。NBD-C6的释放量与所用蛋白质的量相比较。N=3；采用双向方差分析和Bonferroni的后验分析计算显著性对< 0.001; ns，不显著。
图3
图3
不同底物浓度和时间进程对hATGL水解NBD-TAG的影响。A： 将hATGL表达或pcDNA3对照质粒转染的Cos-7细胞裂解物（100μg蛋白）与不同量的NBD-TAG孵育（n=4）1h。提取脂质后，测量荧光读数，并使用标准曲线量化NBD-C6水平。B： 将来自hATGL表达或pcDNA3对照质粒转染的Cos-7细胞的细胞裂解物（100μg蛋白）与10μl（880 pmol）NBD-TAG孵育不同时间（n=4）。脂质提取后，测量荧光读数。绘制了单个值。采用双向方差分析和Bonferroni的后验分析计算显著性对< 0.001.
图4
图4
时间进程和蛋白质浓度对PC/PI囊泡中使用NBD-TAG的hATGL活性的影响。A和B：PC和PC/PI囊泡作为底物的比较。pcDNA3或hATGL转染的Cos-7细胞裂解物（100μg蛋白）与含有NBD-TAG（10μl，880 pmol）的PC囊泡或PC/PI囊泡孵育（n=3）1h。平行制备NBD-C6的标准曲线以量化释放的FFA。A： 在0、5、10、30、45和60分钟时测量NBD荧光，并使用NBD-C6标准曲线计算FFA释放。B： 培养1小时后，按照前面的描述提取FFA，并测量NBD荧光读数以计算FFA浓度。C： 时间和蛋白质浓度对底物水解的影响。将来自转染pcDNA3或hATGL表达质粒的Cos-7细胞的不同数量的裂解蛋白与含有PC/PI囊泡的NBD-TAG（10μl，880 pmol）孵育。在不同的时间间隔读取荧光读数，以测量水解的时间进程。误差线代表SD。对于A和C，使用双向方差分析计算显著性，然后进行Bonferroni的后验分析。对于B，先进行单因素方差分析，然后进行Bonferroni的后验分析对< 0.001. 实验结果代表了两个或三个独立的实验。
图5
图5
底物浓度和温度对hATGL活性的影响。A： 将表达hATGL或pcDNA3对照质粒转染的Cos-7细胞裂解物（100μg蛋白质）与不同量的NBD-TAG在PC/PI底物囊泡中孵育1小时。A： 孵育1小时后测量荧光。使用NBD-C6标准曲线定量释放的FFA。B： 将hATGL表达质粒或pcDNA3对照质粒转染的Cos-7细胞裂解物（70μg蛋白）与PC/PI NBD-TAG（10μl，880 pmol）底物囊泡在不同温度下孵育1h。在孵育期间的不同时间间隔读取NBD荧光读数，并量化NBD-C6的释放量。误差条代表SD，n=3。使用双向方差分析和Bonferroni的后验分析计算显著性；***对< 0.001. 结果代表了三到五个独立实验。
图6
图6
不同抑制剂对hATGL和mATGL的影响。A： 用表达His-tagged LacZ、mATGL或hATGL的质粒转染Cos-7细胞。在凝胶上分离细胞裂解物（20μg），并用抗-His抗体（顶部）进行探测。在另一种凝胶中，肌动蛋白被探测，以显示不同孔（底部）中细胞蛋白的负载相等。B： 将LacZ-、mATGL-或hATGL-表达的Cos-7细胞裂解物（50μg）与NBD-TAG（10μl，880 pmol）底物孵育1 h。在孵育期间的不同时间间隔测量荧光，以计算释放的FFA。采用单因素方差分析和多重比较检验计算显著性。误差条代表SD.C:hATGL和（D）mATGL转染的Cos-7细胞裂解物（50μg）与NBD-TAG（10μl，880 pmol）底物在DMSO、atglistin（100μM）、orlistat（20μM）或SC206328（20μM）存在下孵育。在孵育1小时期间的不同时间点测量荧光，以计算释放的FFA。这些图表代表了三到七个独立实验，每个实验有三个生物复制品。误差条表示SD；***对通过双向方差分析和多重比较测试计算得出<0.001。
图7
图7
测定LpL活性并研究不同抑制剂对其活性的影响。A： 将纯化牛乳LpL（0.3μg）与880 pmol NBD-TAG在PC/PI囊泡中孵育15分钟，增加小鼠血浆量，并根据平行制备的NBD-C6标准曲线计算释放的FFA。B： 不同浓度的纯化LpL与880 pmol底物囊泡在5%小鼠血浆中孵育。在15分钟时测量NBD荧光。C： LpL（0.3μg）与不同浓度的NBD-TAG底物在5%小鼠血浆中孵育15分钟。D： LpL（0.3μg）和5%小鼠血浆与880 pmol NBD-TG囊泡在DMSO、atglistatin（100μM）、orlistat（20μM）或SC20638（20UM）存在下孵育。在不同时间点测量NBD荧光。使用NBD-C6标准曲线计算释放的FFA。误差条表示SD，n=3；***对<0.001，双向方差分析，然后进行多重比较测试。
图8
图8
使用NBD-TAG在两种不同载体中测量脂肪酶活性。A： 放大50000倍的PC/PI乳液中1:6和7:1 NBD-TAG到PC的TEM图像。B： 将pcDNA3或hATGL转染的Cos-7细胞裂解物（100μg）与10μl（880 pmol）1:6 NBD-TAG:PC囊泡或3.5μl（88 pmol）7:1 NBD-TAG：PC囊泡在PC/PI囊泡中孵育，并在孵育1 h的不同时间点测量荧光。C： hATGL转染的Cos-7细胞裂解物（70μg）与10μl（3155 pmol）7:1 NBD-TAG:PC在PC/PI乳液中在DMSO或奥利司他（20μM）存在下培养。在孵育1小时期间的不同时间点测量荧光，以计算释放的FFA。D： LpL（0.3μg）和5%小鼠血浆与10μl（3155 pmol）7:1 NBD-TAG:PC在PC/PI乳液中在DMSO或奥利司他（20μM）存在下孵育。在不同时间点测量NBD荧光。使用NBD-C6标准曲线计算释放的FFA。N=3，***对通过双向方差分析和多重比较测试计算的显著性<0.001。
图9
图9
使用7:1 NBD-TAG:PC在PC/PI囊泡中测量mHSL活性。A： 用pcDNA3或His-tagged mHSL转染Cos-7细胞。在凝胶上分离细胞裂解物（20μg），并用抗-His抗体进行探测。在另一种凝胶中，对肌动蛋白进行探测，以显示细胞蛋白质的负载量相等。B： pcDNA3或mHSL转染的Cos-7细胞裂解物（100μg）与7:1 NBD-TAG:PC（10μl，3155 pmol）底物孵育1h。在孵育期间的不同时间间隔测量荧光，以计算释放的FFA。C： pcDNA3或mHSL转染的Cos-7细胞裂解物（100μg）与不同量的7:1 NBD-TAG:PC（10μl，3155 pmol）底物孵育1h。在孵育期间的不同时间间隔测量荧光，以计算释放的FFA。D： mHSL转染的Cos-7细胞裂解物（100μg）与7:1 NBD-TAG:PC（10μl，3155 pmol）底物在DMSO、atglistatin（100μM）、orlistat（20μM）或SC206328（20μM）存在下孵育。在孵育1小时期间的不同时间点测量荧光，以计算释放的FFA。这些图表代表了两到三个独立的实验，每个实验都有三个生物复制品。误差条代表SD；**对<0.01和***对通过双向方差分析和多重比较测试计算得出<0.001。
图10
图10
喂食小鼠胰腺中PTL活性及不同抑制剂的影响。A： 收集未经消化的C57BL/6小鼠的胰腺，并在改良的缓冲液K中均质。蛋白质（40μg）与NBD-TAG囊泡（10μl，3155 pmol）混合，不存在或存在越来越多的大肠杆菌蛋白酶。5分钟后，用平板测量不同时间点的NBD荧光。B： 用不同浓度的NBD-TAG底物培养含有80 ng大肠杆菌蛋白酶的组织匀浆（40μg）。1小时后，用平板测量NBD荧光。C： 将含有80 ng大肠杆菌蛋白酶的组织匀浆（40μg）与NBD-TAG囊泡（10μl，3155 pmol）在DMSO、atglistatin（100μM）、orlistat（20μM）或SC206328（20μM）存在下培养5分钟。在不同时间点测量NBD荧光。在这些研究中，使用NBD-C6标准曲线计算FFA浓度。误差线代表SD，n=3个技术复制对<0.001，双向方差分析，然后进行多重比较分析。
图11
图11
在喂食和禁食条件下测量小鼠eWAT中的ATGL和HSL活性。未绝食（n=3）和禁食（n=3）过夜（16h）的C57BL/6小鼠于上午10点安乐死，并在心内灌注生理盐水后收集eWAT。A： 用7:1 NBD-TAG:PC囊泡（10μl，3155 pmol）孵育来自非饥饿小鼠的不同数量的eWAT匀浆。1小时后，测量NBD荧光。B： 将非饥饿小鼠的eWAT匀浆（100μg）与不同浓度的NBD-TAG底物孵育，1h后测量NBD荧光。C： 喂食和禁食小鼠的eWAT匀浆（100μg）与7:1 NBD-TAG:PC囊泡（10μl，3155 pmol）在DMSO、atglistatin（100μM）或SC206328（20μM）存在下孵育。1小时后，测量NBD荧光。N=3，误差条代表SD*对<0.05，***对经单因素方差分析和多重比较计算，<0.01。D和E：使用存在和不存在atglistatin（D）或SC206328（E）时FFA释放的差异，分别计算从喂食和禁食小鼠获得的eWAT中的ATGL和HSL特异性活性。N=3，误差条代表SD，显著性由未配对学生计算t吨测试**对< 0.01.
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