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.2022年4月；17(4):887-897.
doi:10.4103/1673-5374.322475。

HOTTIP下调减少帕金森氏病细胞和小鼠模型中的神经元损伤和小胶质细胞激活

彭伦 1, 陶骥 2, 德宏湾 1, 夏柳 三, 陈晓东 4, 帅余 4, 孙鹏 1
附属公司

HOTTIP下调可减少帕金森病细胞和小鼠模型中的神经元损伤和小胶质细胞活化

彭伦等。 神经再生研究. 2022年4月.

摘要

末端HOXA转录物（HOTTIP）是一种新发现的长非编码RNA，具有抗炎作用并抑制氧-葡萄糖剥夺诱导的神经元凋亡。然而，其在帕金森病（PD）中的作用尚不清楚。1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+)分别用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）在SH-SY5Y和BV2细胞以及C57BL/6雄性小鼠中建立PD模型。体外，通过sh-HOTTIP转染HOTTIP基因敲除HOTTIP后，HOTTIP和FOXO1过度表达促进sh-SY5Y凋亡、BV2小胶质细胞活化、促炎性细胞因子表达，以及核因子kappa-B和NACHT、LRR和PYD域包含蛋白3的炎性体激活。miR-615-3p过度表达抑制MPP+-诱导神经元凋亡和小胶质细胞炎症，改善HOTTIP和FOXO1介导的神经损伤和炎症。在体内，HOTTIP敲除可减轻PD小鼠的运动功能障碍，并减少黑质的神经元凋亡和小胶质细胞激活。这些发现表明，抑制HOTTIP通过调节miR-615-3p/FOXO1减轻PD模型中的神经元凋亡和小胶质细胞激活。本研究于2018年6月获得中国青岛大学附属医院伦理审查委员会批准（批准号：UDX-2018-042）。

关键词：HOTTIP；NLRP3；帕金森病；细胞凋亡；炎症；miR-615-3p；神经元；非编码RNA。

PubMed免责声明

利益冲突声明

无

数字

图1
图1
MPP公司+SH-SY5Y和BV2细胞中HOTTIP/miR-615-3p/FOXO1表达的诱导变化用MPP处理SH-SY5Y和BV2细胞+（12.5–100μM）持续24小时。（A–F）逆转录-聚合酶链反应用于检测SH-SY5Y和BV2细胞中HOTTIP（A，B）、miR-615-3p（C，D）和FOXO1 mRNA（E，F）的表达（折叠至对照）。（G，H）Western blot用于测量两种细胞系中FOXO1水平（折叠至对照）。数据表示为平均值±SD。实验重复三次*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001,与.控制组（学生的t吨-测试）。FOXO1：叉盒蛋白O1；HOTTIP：远端HOXA转录本；MPP公司+：1-甲基-4-苯基吡啶；NS：不显著；veh：车辆组。
图2
图2
HOTTIP/miR-615-3p在调节MPP中的作用+-SH-SY5Y细胞诱导的神经元毒性用HOTTIP/miR-615-3p过表达载体转染（A–C）SH-SY5Y细胞。（A，B）逆转录聚合酶链反应用于检测HOTTIP（A）和miR-615-3p（B）mRNA的表达（折叠至对照）。（C） 采用CCK8法测定细胞活力。用MPP处理转染HOTTIP/miR-615-3p过表达载体的（D–I）SH-SY5Y细胞+（100μM）持续24小时。（D） 流式细胞仪检测细胞凋亡。（E） CCK8用于测定细胞活力。流式细胞术检测（F，G）细胞凋亡。凋亡细胞的百分比由右上象限中的数值表示。（H，I）Western blot用于测量裂解的Caspase-3、Bax和Bcl2以及NLRP3-ASC-叶Caspase-1炎性体的蛋白表达（对照倍数）。数据表示为平均值±SD。实验重复三次*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001,与.对照组&P（P）< 0.05, &&P（P）< 0.01, &&&P（P）< 0.001,与.MPP++矢量群##P（P）< 0.01, ###P（P）< 0.001,与.MPP（MPP）++lnc小组（学生t吨-测试）。ASC：包含CARD结构域的衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白；CCK8：细胞计数套件-8；HOTTIP：远端HOXA转录本；lnc：长非编码；miR：微小RNA；MPP公司+：1-甲基-4-苯基吡啶；NLRP3:NLR家族吡啶结构域包含3；NS：不显著；OD：光密度。
图3
图3
HOTTIP/miR-615-3p在调节MPP中的作用+-小胶质细胞介导的炎症（BV2细胞）用HOTTIP或miR-615-3p过表达载体转染BV2细胞，然后用MPP处理+（100μM）持续24小时。（A） ELISA检测BV2细胞产生的IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α水平。（B–D）Western blot用于测量促氧化蛋白iNOS和COX2（B）、促炎症蛋白磷酸化NF-κB（C）和NLRP3-ASC-叶Caspase-1炎性体（D）的活化（折叠为对照）。数据表示为平均值±SD。实验重复三次**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001,与.对照组&P（P）< 0.05, &&P（P）< 0.01, &&&P（P）< 0.001,与.MPP（MPP）++矢量群#P（P）< 0.05, ##P（P）< 0.01, ###P（P）< 0.001,与.MPP（MPP）++lnc小组（学生t吨-测试）。ASC：包含CARD结构域的衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白；COX2：环氧合酶-2；ELISA：酶联免疫吸附试验；HOTTIP：远端HOXA转录本；IL：白细胞介素；iNOS：诱导型一氧化氮合酶；lnc：长非编码；miR：微RNA；MPP公司+：1-甲基-4-苯基吡啶；NF-κB：核因子κB；NLRP3:NLR家族吡啶结构域包含3；TNF-α：肿瘤坏死因子-α。
图4
图4
HOTTIP和FOXO1均靶向SH-SY5Y和BV2细胞中的miR-615-3p（A，B）使用Starbase数据库，我们发现miR-615-3p含有与HOTTIP和FOXO1结合的碱基序列。（C–E）逆转录聚合酶链式反应或蛋白质印迹用于比较在不同处理下SH-SY5Y和BV2细胞中HOTTIP（C）、miR-615-3p（D）和FOXO1（E）的mRNA和蛋白质表达（与对照相比倍数）。（F，G）逆转录聚合酶链反应用于测定miR-615-3p和HOTTIP（热提示）在SH-SY5Y和BV2细胞中。靶mRNA表达通过U6型对照组细胞核和细胞质表达。在SH-SY5Y和BV2细胞中转染（H，I）HOTTIP-wt、HOTTIP-mut、FOXO1-wt和FOXO1-mut，以及miR-NC和miR-615-3p，并进行双核糖核酸酶报告分析。数据表示为平均值±SD。实验重复三次***P（P）< 0.001,与.对照组&P（P）< 0.05, &&P（P）< 0.01, &&&P（P）< 0.001,与.MPP（MPP）++矢量群#P<0.05##P（P）< 0.01, ###P（P）< 0.001,与.MPP（MPP）++lnc集团；††P（P）<0.01（学生的t吨-测试）。FOXO1：叉盒蛋白O1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；HOTTIP：远端HOXA转录本；lnc：长非编码；miR：微RNA；MPP公司+：1-甲基-4-苯基吡啶；NS：不显著。
图5
图5
FOXO1过度表达加剧MPP+-SH-SY5Y细胞诱导的神经元损伤（A）在SH-SY5Y细胞中构建FOXO1过表达细胞模型，并通过western blot检测FOXO1-蛋白表达。（B） 用miR-615-3p转染过表达FOXO1的细胞并用MPP处理+（100μM）24小时，然后通过western blot检测FOXO1蛋白表达（折叠到载体）。（C） 使用细胞计数试剂盒-8评估细胞活力。（D） 流式细胞术检测细胞凋亡。（E，F）Western blot用于测量水平（MMP的倍数+细胞凋亡相关蛋白（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、Bax和Bcl2）和NLRP3-ASC-半胱氨酸蛋白酶-1炎症小体的载体）。数据以平均值±标准差表示。实验重复三次。††P（P）< 0.01, †††P（P）<0.001（学生的t吨-测试）。ASC：包含CARD结构域的衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白；FOXO1：叉盒蛋白O1；miR：微RNA；MPP公司+：1-甲基-4-苯基吡啶；NLRP3:NLR家族吡啶结构域包含3；NS：不显著。
图6
图6
FOXO1增强了MPP的作用+-小胶质细胞（BV2细胞）的诱导炎症（A）在BV2细胞中构建FOXO1过表达细胞模型，并通过western blot测定FOXO1protein水平（折叠到载体）。（B） 用miR-615-3p转染过表达FOXO1的BV2细胞并用MPP处理+（100μM）持续24小时。FOXO1蛋白表达（乘以MMP+western blot检测载体）。（C） ELISA法检测BV2细胞产生的IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α水平。（D–F）Western blot用于测量前氧化蛋白iNOS和COX2（D）、促炎症蛋白磷酸化NF-κB（E）和NLRP3-ASC-叶Caspase-1炎症小体（F）的活化（折叠为对照）。数据表示为平均值±标准偏差。实验重复三次。†P（P）< 0.05, ††P（P）< 0.01, †††P（P）<0.001（学生的t吨-测试）。ASC：包含CARD结构域的衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白；COX2：环氧合酶-2；ELISA：酶联免疫吸附试验；FOXO1：叉盒蛋白O1；IL：白细胞介素；iNOS：诱导型一氧化氮合酶；MPP公司+：1-甲基-4-苯基吡啶；NLRP3:NLR家族pyrin结构域，包含3个；TNF-α：肿瘤坏死因子-α。
图7
图7
HOTTIP敲除减轻PD小鼠的神经功能障碍和神经元损伤MPTP用于诱导PD小鼠模型。在PD小鼠模型中，使用Sh HOTTIP来敲除HOTTIP。（A） 进行了旋转杆测试以评估运动功能。（B，C）通过跌倒潜伏期和握力检查前肢肌肉力量。（D） 极点试验用于检查运动迟缓。（E，F）免疫组织化学和western blot检测黑质区TH标记神经元和TH蛋白表达（折叠到假）。与假手术组相比，MPTP和MPTP+sh-NC组TH阳性细胞减少。HOTTIP击倒增加了PD小鼠的TH阳性细胞。（G） 免疫组织化学检测Caspase-3标记的凋亡神经元数量。（H） 通过western blot检测黑质中裂解Caspase-3、Bax和Bcl2的表达（折叠到假）。（一） 采用高效液相色谱法测定纹状体区多巴胺含量。数据表示为平均值±SD(n个= 5). §§§P（P）< 0.001,与sham组P（P）< 0.001,与.MPTP+sh-NC组（学生t吨-测试）。HOTTIP:远端的HOXA转录物；MPTP：1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶；PD：帕金森病；TH：酪氨酸羟化酶。
图8
图8
HOTTIP基因敲除抑制PD小鼠的神经炎症和小胶质细胞活化（A，B）通过免疫组织化学和western blot（fold to sham）检测黑质区小胶质细胞活化（Iba1标记）。与假手术组相比，MPTP和MPTP+sh-NC组TH阳性细胞增加。HOTTIP敲除降低PD小鼠的TH阳性细胞。（C） ELISA法检测PD小鼠黑质区IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α水平。（D–F）Western blot用于测量前氧化蛋白iNOS和COX2、前炎性蛋白磷酸化NF-κB和NLRP3-ASC-叶Caspase-1炎性体的表达（折叠到假）。（G，H）逆转录聚合酶链反应用于测量黑质区HOTTIP（G）和miR-615-3p（H）水平（折叠到假）。（一） Western blot用于测量黑质区FOXO1水平（折叠到假）。数据表示为平均值±SD(n个= 5). §§P（P）< 0.01, §§§P（P）< 0.001,与.假手术组P（P）< 0.01, ‡‡‡P（P）< 0.001,与.MPTP+sh-NC组（学生t吨-测试）。ASC：包含CARD结构域的衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白；COX2：环氧合酶-2；ELISA：酶联免疫吸附试验；FOXO1：叉盒蛋白O1；HOTTIP:远端的HOXA转录物；Iba1：棕色脂肪细胞的诱导1；IL：白细胞介素；iNOS：诱导型一氧化氮合酶；NF-κB：核因子κB；NLRP3:NLR家族吡啶结构域包含3；PD：帕金森病；TNF-α：肿瘤坏死因子-α。
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