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.2021年9月16日；184（19）：4886-4903.e21。
doi:10.1016/j.cell.2021.08.001。 Epub 2021年8月24日。

双重膜状细胞器使正交真核生物翻译的空间分离成为可能

克里斯托弗·德莱因克迈尔 1, 爱德华·A·莱姆克 2
附属机构

双重膜状细胞器使正交真核生物翻译的空间分离成为可能

克里斯托弗·德莱因克迈尔等。 单元格. .

摘要

通过酶进化或从头开始的蛋白质设计将新功能引入活的真核生物系统是一项艰巨的挑战。细胞并不完全依赖于基于DNA的进化来产生新的功能，而是经常利用膜包裹或无膜细胞器的形成来分离执行复杂操作的不同分子过程。应用这一原理和二维相分离的概念，我们开发了支持各种细胞膜表面蛋白质翻译的膜状合成细胞器。这些亚分辨率合成膜为在同一细胞内制造功能不同的酶提供了一条途径。我们使用这些膜状细胞器为真核细胞装备双正交扩展遗传密码，使不同翻译机制的特定重编程具有单残基精度。在几十纳米范围内空间调节翻译输出的能力不仅对合成生物学很重要，而且对理解细胞中膜相关蛋白凝聚的功能也有意义。

关键词：二维相分离；酶工程；遗传密码扩展；膜信号；正交翻译；合成生物学；合成生物分子缩合物。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益声明C.D.R.和E.A.L.已就OT细胞器技术申请专利（EP 19157257.7）。

数字

无
图形摘要
图1
图1
多个正交翻译（OT）细胞器为细胞配备多个正交扩展遗传密码（A）我们的实验设计：在一个细胞中形成两个完全正交的OT细胞器为宿主配备两个正交遗传密码。只有选定的mRNA被翻译成相应的扩展遗传密码，因此只有选定的蛋白质含有特定的ncAA。汇编器是一种合成-细胞形成单元，类似于蛋白质缩合功能。选择一个RNA-binding结构域（RBD）来结合其同源RNA基序（RM），该基序与3′非翻译区中感兴趣蛋白（POI）的mRNA融合。（B） 为了构建多个OT细胞器，需要满足三个标准：独立组装、选择性RNA募集和独特的ncAA特异性。（C） 靶向OT细胞器发育的膜的示意图。（D–G）本研究中合成细胞器类别概述。在细胞膜、PylRS和MCP或λ的细胞质表面开发OT细胞器N22气体多肽融合到相分离组装子FUS以及膜靶向结构域。
图2
图2
移植到细胞膜上的合成膜状细胞器能够实现高度选择性的正交翻译（A）用于测试OT细胞器和理论FFC图的双色报告器的示意图。编码EGFP和mCherry的mRNA在允许位点带有琥珀色密码子，由一个质粒表达。mCherry mRNA标记有特定的RNA基序（RMs）。在细胞质GCE的情况下，应生成全长EGFP和mCherry，并在FFC分析中给出近似对角线（以橙色显示）。如果OT细胞器选择性地工作，则只会产生mCherry，这将导致FFC分析中的mCherry阳性群体（显示为红色）。未转染细胞用灰色圆圈表示。（B和C）OT细胞器选择性的FFC分析。HEK293T细胞表达指示的报告子和GCE系统以及tRNA派尔在SCO-K的存在下，显示了至少三个独立实验的总和。FFC点图中的黑线表示用于识别转染细胞的EGFP信号截止。（D和E）与（B）和（C）中所示的FFC实验相对应的条形图。深灰色条显示折叠变化选择性，定义为mCherry与EGFP的平均荧光强度之比，归一化为相应的细胞质GCE对照（PylRS）。浅灰色条表示相对效率，定义为每种条件下mCherry的平均荧光强度除以细胞质GCE对照（PylRS）的荧光强度。条形图显示了至少三个独立实验的平均值；误差条表示标准偏差（SD）。（F） 表达双标记成像报告基因（Nup153:：EGFP）的HEK293T细胞149标签：：方框B，H2B:：m樱桃190标签：：ms2）和tRNA派尔以及所示OT膜状细胞器或细胞质GCE系统（第一列）。实验在SCO-K存在下进行。比例尺，20μm。另请参见图S5。
图3
图3
相分离组装器对大多数OT膜样细胞器的功能至关重要（A）针对PylRS和/或MCP的构建物的示意图，分别针对四个膜，包括FUS/EWSR1或不包括FUS/EWSR1。小写的“s”表示PylRS和MCP不是基因融合的，而是从不同的质粒表达的。（B） 表达双色ms2报告子（EGFP）的HEK293T细胞的FFC分析39标签，m樱桃190标签：：ms2），tRNA派尔图S1A显示了进一步的对照。FFC点图中的黑线表示用于识别转染细胞的EGFP信号截止，红色虚线表示每个靶膜的背景表达（在没有MCP的情况下）。（C） 与FFC实验相对应的条形图如（B）所示。深灰色条表示折叠变化的选择性，浅灰色条表示相对效率（参见图2B了解相应的细胞质PylRS控制）。条形图显示了至少三个独立实验的平均值；误差条表示单独OT细胞器结构的SD（D）FFC分析。表达双色ms2报告子（EGFP）的HEK293T细胞39标签，m樱桃190标签：ms2），tRNA派尔，一个各自的PylRS OT细胞器结构，并且没有MCP或MCP靶向每个相应的膜。显示了至少三个独立实验的总和。FFC点图中的黑线表示用于识别转染细胞的EGFP信号截止。（E和F）根据（D）中显示的FFC数据计算的热图，用于可视化单个共表达结构的折叠变化选择性（E）和相对效率（F）。显示了所有实验的平均值。热图的上半部分对应于（D）中所示的数据。热图的下半部分显示了双色盒B报告器（EGFP）的相应数据39标签，m樱桃190标签：：方框B），tRNA派尔，一个各自的PylRS融合，或者没有λN22气体构造（第10行）或λN22气体靶向所示膜的肽（相应FFC点图见图S1B，相关成像实验见图S4）。MCP/λ时显示白色星形第22页和PylRS靶向相同的膜。另请参见图S6。
图S1
图S1
相分离域对于大多数系统和boxB-λ的几种组合来说是必不可少的N22气体系统满足独立的组装标准，如图3（A）所示。为了测试不同的膜系统是否需要相分离域，我们使用了将PylRS或MCP分别与四个膜结合或结合FUS/EWSR1的结构。在这里，我们展示了具有和不具有相分离域的单独OT细胞器的FFC分析（即带有和不带FUS的PylRS以及带有和不带有EWSR1的MCP）。表达双色ms2报告子（EGFP）的HEK293T细胞39标签，m樱桃190标签：：ms2），tRNA派尔，没有（上一行）或具有相分离域（下一行）的相应PylRS结构，以及没有MCP蛋白（第一列）或没有（第二列）或在SCO-K存在下具有相分离结构域（第三列）的膜靶向MCP蛋白。对于OMM，ERM和GM系统的变型没有FUS松散功能。只有以PM-为目标的PylRS变体在有和没有相分离域的情况下都是有效的。对于MCP、GM和OMM而言，没有EWSR1的系统表现更差。所示为至少三个独立实验的总和。（请注意，FFC点图中的黑线表示用于识别转染细胞的EGFP信号截止）。四分之三的系统需要蛋白质缩合才能发挥功能，而PM和PMP系统的性能相似，这可能是由于质膜与细胞质的良好空间分离。（B） 测试不同膜系统λ的独立组装标准N22气体–我们克隆的以PylRS或λ为目标的boxB系统构造N22气体肽（分别与FUS或EWSR1）连接到四种不同的膜。这里我们展示了单独OT细胞器结构的FFC分析。表达双色盒B报告子（EGFP）的HEK293T细胞39标签，m樱桃190标签：：方框B），tRNA派尔，一个各自的PylRS OT细胞器结构以及无λN22气体肽（第五列）或λN22气体靶向每个膜的肽。ncAA SCO-K存在于所有实验中。与ms2–MCP系统的实验类似（图3），我们总是观察到预期的高选择性mCherry190标签：：boxB产量，如果λN22气体和PylRS靶向相同的膜（垂直群体）。我们还观察到增强的mCherry190标签：：boxB表达式，如果λN22气体和PylRS是针对GM和ERM或PM的。只有ERMP和PMP系统的组合，以及OMMP系统与任何其他系统的组合没有表现出混合，即在没有λN22气体（背景表达式），如第五行所示（-λN22气体)高于细胞质PylRS控制，因此只有这些符合独立组装标准。所示为至少三个独立实验的总和。[请注意，FFC点图中的黑线表示用于识别转染细胞的EGFP信号截止，红色虚线强调背景表达（如果没有λN22气体)针对每个靶膜]。（C） 识别单个HEK293T细胞的FFC门控方案。首先根据SSC-A和FSC-A值鉴定HEK293T细胞。随后，使用SSC-A和SSC-W参数鉴定单个细胞。显示了一个典型示例。这里，HEK293T细胞被转染了细胞质PylRS系统，即ms2报告基因（EGFP）39标签，m樱桃190标签：：ms2）和tRNA派尔在存在ncAA SCO-K的情况下，通过第一个栅极（顶部）的细胞随后被选通以用于单个细胞（底部）。（D） 表达iRFP:：EGFP的细胞的FFC分析39标签报告人，tRNA派尔和PylRS空军或PylRSAA公司iRFP用作转染对照，而EGFP荧光报告成功抑制琥珀色密码子。细胞在没有ncAA、SCO-K（250μM）、TCO的情况下培养∗A-K（250μM）、Cbz-K（250µM）、3-IF（1 mM）或SCO-Y（250μM）。对于PylRS空军，在SCO-K、TCO存在的情况下观察到强大的EGFP表达∗A-K和Cbz-K。对于PylRSAA公司，EGFP表达仅在3-IF或SCO-Y存在时增强。显示了至少三个独立实验的总和。（请注意，FFC点图中的黑线表示用于识别转染细胞的iRFP信号截止点）。
图4
图4
合成OT膜样细胞器有效招募tRNA派尔和核糖体HEK293T细胞表达指定的OT细胞器、tRNA派尔和EGFP39标签：：ms2在ncAA SCO-K存在下的IF染色对PylRS和tRNA的FISH染色的3D-rendered图像派尔显示强tRNA派尔招募（单个飞机的原始图像见图S2A）。自上而下：PylRS（洋红），tRNA派尔（黄色），合并（NLS:：EGFP39标签：：ms2在所有面板中均显示为绿色）。有关相应的动画，请参见视频S1。比例尺，10μm。（B） 超分辨率显微镜证实tRNA派尔局限于各自膜上的一个精细层。特别是PMPMCP公司系统tRNA派尔似乎仅限于几十纳米的亚分辨率胶片（半高宽，半高宽）。自上而下：tRNA派尔随机光学重建显微镜（STORM）、红色框内区域的放大视图以及对应于红线的线扫描。比例尺，1μm。（C） PylRS和RPL26L1（一种核糖体标记蛋白）IF染色的3D重影图像显示了MCP-基OT细胞器中的内源性核糖体（单个平面的原始图像见图S2B）。由于核糖体的丰富，OT细胞器外的染色也被观察到。自上而下：PylRS（洋红）、RPL26L1（青色）、合并（NLS:：EGFP39标签：：ms2在所有面板中均显示为绿色）。视频S1显示相应的动画。比例尺，10μm。参见图S3和S4。
图S2
图S2
基于MCP的合成膜状细胞器富集tRNA派尔、mRNA：：ms2和细胞核糖体，与图4（A–B）中用于3D渲染的图像相关。表达OT细胞器tRNA的HEK293T细胞派尔，以及编码NLS:：EGFP的构造39标签：：ms2（存在ncAA SCO-K）。所有图像均显示z堆栈的选定平面。（A） 对应于图4A。PylRS的IF染色和tRNA的FISH染色派尔表现出强烈的tRNA派尔招聘。自上而下：PylRS（洋红），tRNA派尔（黄色），合并（NLS:：EGFP39标签：：ms2显示为绿色）。（B） 对应于图4C。对PylRS和RPL26L1的IF染色显示内源性核糖体被募集到OT膜样细胞器中。注意，由于核糖体的丰富，可以观察到OT细胞器外的大量染色。自上而下：PylRS（洋红）、RPL26L1（青色）、合并（NLS:：EGFP39标签：：ms2为绿色）。比例尺：20μm。（C） PylRS的IF染色和mRNA：：ms2的FISH染色显示ms2标记的mRNA招募到膜相关OT细胞器中。自上而下：PylRS（洋红色），mRNA：：ms2（黄色），合并（NLS：：EGFP39标签：：ms2为绿色）。
图S3
图S3
与图4（A–D）HEK293T细胞表达所示OT细胞器、tRNA相关的不同OT膜样细胞器构建物的其他多色染色派尔和双重招聘记者（EGFP39标签：：方框B，mCherry190标签：：ms2）。所有图像均显示z堆栈的选定平面。比例尺：20μm。（A） 针对PylRS和质膜标记物（NaK-ATP酶）的IF染色。从上到下：PylRS（品红色），NaK ATP酶（青色），NLS:：EGFP39标签：：方框B（蓝色），NLS:：m樱桃色190标签：：ms2（黄色）并合并。（B） 针对PylRS和高尔基膜标记物（Giantin）的IF染色。自上而下：PylRS（洋红色）、Giantin（青色）、NLS:：EGFP39标签：：方框B（蓝色），NLS:：m樱桃色190标签：：ms2（黄色）并合并。（C） 针对PylRS和ER膜标记物（Calnexin）的IF染色。自上而下：PylRS（洋红）、Calnexin（青色）、NLS:：EGFP39标签：：方框B（蓝色），NLS:：m樱桃色190标签：：ms2（黄色）并合并。（D） 针对PylRS和线粒体标记物（凋亡诱导因子，AIF）的IF染色。从上到下：PylRS（洋红色）、AIF（青色）、NLS:：EGFP39标签：：方框B（蓝色），NLS:：m樱桃色190标签：：ms2（黄色）并合并。注意，我们没有100%的转染效率，而所有使用的标记物都是细胞内源性的。
图S4
图S4
单独的OT细胞器系统共同定位MCP、PylRS、tRNA派尔和核糖体，与图3（A）所用结构的概述卡通有关。小写“秒“表明PylRS和MCP是由两个单独的质粒表达的，而不是遗传融合的。（B–D）HEK293T细胞表达指定的OT细胞器、tRNA派尔和构造编码NLS:：EGFP39标签：：ms2（存在ncAA SCO-K）。所有图像均显示z堆栈的选定平面。比例尺：20μm。（B） PylRS的IF染色和tRNA的FISH染色派尔显示强tRNA派尔募集到膜相关的OT细胞器中。从上到下：PylRS（品红色），tRNA派尔（黄色），合并（NLS:：EGFP39标签：：ms2为绿色）。（C） 对PylRS和RPL26L1的IF染色显示内源性核糖体与OT膜样细胞器共定位。请注意，由于RPL26L1是一种内源性蛋白，未转染细胞也会被染色。自上而下：PylRS（洋红）、RPL26L1（青色）、合并（NLS:：EGFP39标签：：ms2为绿色）。（D） 针对PylRS和MCP的IF染色（使用抗HA抗体）显示OT细胞器中的共同定位。从上到下：PylRS（品红色）、MCP（黄色）、合并（NLS:：EGFP39标签：：ms2为绿色）。（E，F）HEK293T细胞表达指定的OT细胞器、tRNA派尔和构造编码EGFP39标签：：boxB（存在SCO-K）。所有图像均显示z堆栈的选定平面。比例尺：20μm。（E） 针对PylRS和λ的IF染色N22气体（与抗Myc抗体）在OT细胞器中显示共定位。从左到右：PylRS（洋红），λN22气体（黄色），合并（NLS:：EGFP39标签：：方框B为绿色）。（F） 对PylRS和RPL26L1的IF染色显示内源性核糖体与膜相关OT细胞器共定位。注意，由于核糖体的丰富，可以观察到OT细胞器外的大量染色。从左到右：PylRS（洋红色）、RPL26L1（青色）、合并（NLS:：EGFP39标签：：方框B为绿色）。
图S5
图S5
λN22气体-基于合成细胞器的tRNA富集派尔，mRNA：：boxB和细胞核糖体，与图2C HEK293T细胞相关，表达所指示的OT细胞器tRNA派尔和构造编码EGFP39标签：：boxB存在ncAA SCO-K。所有图像均显示z堆栈的选定平面。（A） PylRS的IF染色和tRNA的FISH染色派尔显示tRNA的强烈招募派尔进入OT细胞器。从左到右：PylRS（洋红），tRNA派尔（黄色），合并（NLS:：EGFP39标签：：ms2，绿色）。所示为z堆栈的选定平面。比例尺：20μm。（B） 与面板A相对应的3D重建。从左到右：PylRS（洋红），tRNA派尔（黄色），合并（NLS:：EGFP39标签：：ms2在所有面板中均为绿色）。有关动画3D重建的信息，请参见视频S1。比例尺：10μm。（C） 对PylRS和RPL26L1的IF染色显示内源性核糖体与膜相关OT细胞器共存。注意，由于核糖体的丰富，可以观察到OT细胞器外的大量染色。从左到右：PylRS（洋红色）、RPL26L1（青色）、合并（NLS:：EGFP39标签：：ms2为绿色）。所示为z堆栈的选定平面。比例尺：20μm。（D） 与面板C相对应的3D重建。从左到右：PylRS（洋红色）、RPL26L1（青色）、合并（NLS:：EGFP39标签：：ms2在所有面板中均为绿色）。有关3D动画重建的信息，请参见视频S1。比例尺：10μm。（E） 针对PylRS的IF染色和mRNA的FISH染色：：boxB显示boxB标记的mRNA招募到λN22气体-基于OT细胞器。从左到右：PylRS（洋红色），mRNA：：boxB（黄色），合并（NLS：：EGFP39标签：：ms2为绿色）。比例尺：20μm。
图S6
图S6
基于BoxB和ms2的mRNA募集系统符合选择性RNA募集标准，如图3所示。为了测试标记有BoxB或ms2环的mRNA是否选择性募集到各自的细胞器中，这两个双色报告子与没有RNA募集域的膜定位OT细胞器共表达，MCP或λN22气体肽。（A，B）除了显示的OT细胞器和报告细胞外，细胞还表达tRNA派尔并与ncAA SCO-K孵育。作为对照，用编码细胞质PylRS变体的构建物转染细胞。所示为至少三个独立实验的总和。（A） 对ms2报告者的FFC分析显示，mCherry仅在基于MCP的OT细胞器存在的情况下选择性表达。（B） 类似地，boxB-tagged mCherry仅在λ存在时选择性表达N22气体-基于OT细胞器。PylRS公司空军和PylRSAA公司表现出正交基质特性。请注意，FFC点图中的黑线表示用于识别转染细胞的EGFP信号截止。（C） 热图显示了与（A，B）中所示的FFC数据相对应的选择性和相对效率的折叠变化。对于选择性和效率，显示了三个实验的平均值。
图S7
图S7
λ存在时boxB-和ms2-标记mRNA的GCEN22气体-或基于MCP的OT细胞器，与图5（A，C，F）对表达双招募报告基因（EGFP）的HEK293T细胞的FFC分析有关39标签：：方框B，mCherry190标签：：ms2）和tRNA派尔以及指定的GCE系统，前提是存在指定的ncAA。所示为至少三个独立实验的总和。（A） 在这些实验中，400 ng报告基因和tRNA质粒与100 ng OT细胞器构建物和300 ng模拟质粒共同转染。在存在基于MCP的OT细胞器时，mCherry表达占主导地位，而在存在λN22气体-主要产生基于OT细胞器的全长EGFP。（B） 条形图显示mCherry信号与EGFP信号的比率，对应于图B中的条件，标准化为细胞质GCE系统（见a）。该比率以对数标度显示，因此正对数值表示mCherry比EGFP表达更高，而负对数比率对应于EGFP比mCherry过量，接近零的比率表示EGFP和mCherry表达相等。（C） 在这些实验中，400 ng报告基因和tRNA质粒与100 ng OT细胞器构建物和200 ng模拟质粒共同转染。令我们惊讶的是，尽管我们所有的OT细胞器都符合所有测试的正交性标准，包括与细胞质中寄主机械的正交性（A和B），但出乎意料的是，当在一个细胞中表达时，没有一个组合产生两个彼此正交的细胞器。如果OMMPλN22，AF与PMP结合MCP、AA，全长EGFP39标签和mCherry190标签表达独立于添加的ncAA。类似地，如果OMMPλN22，AA与ERMP结合MCP、AF，两种全长EGFP的大量表达39标签和mCherry190标签在所有条件下均观察到。这种选择性丧失的一个可能解释是，一个或多个细胞器成分“泄漏”，并通过一种意想不到的机制在两个细胞器之间穿梭。mRNA募集可能不是选择性损失的原因，因为我们证明了它在不同的募集系统之间是选择性的（图S6）。我们还证明OMMP系统与PMP和ERMP系统正交（图3和S1），因此细胞器组装本身不会导致选择性损失。另一种解释是，在氨酰化后，tRNA派尔（可能在具有伸长因子的复合体中）可以在细胞器之间穿梭。注意，每个细胞器充电的tRNA相同派尔使用不同的ncAA。然而，为此目的，它会通过细胞质扩散，破坏我们专门测试的细胞质翻译选择性（图2）。我们进一步证明了tRNA派尔在FISH染色中，可以沿着陡峭的梯度进行浓缩（图4）。因此，氨酰化tRNA的扩散派尔不太可能是选择性损失的原因。由于已知PylRS作为二聚体具有活性（Kavran等人，2007年；Wan等人，2014年），另一种推测是，在适当的膜定位之前，二聚体可能会在某些合成酶分子被分类到亚细胞目的地之前，将其错定目标。（D） 条形图类似于（B）中的条形图，对应于面板C中的条件，并归一化为细胞质GCE系统（参见面板a）。（E） 为了研究这一点，我们对两种合成酶变体进行了IF染色，一种针对PM或ERM，另一种针对OMM（针对MCP和λ染色N22气体对应于面板C中的条件）。我们观察到PM或ERM靶向合成酶确实与OMM靶向的合成酶混合。这对于PM靶向合成酶尤其明显，其中相当一部分重新定位到OMM。从上到下：MCP，λN22气体、mCherry、EGFP和合并（黄色MCP，λN22气体蓝色为mCherry（洋红），绿色为EGFP（绿色）。比例尺：20μm。令人欣慰的是，当以PylRS:：FUS:：PylRS融合的形式构建二聚体PylRS时，我们获得了所需的相互正交的膜状细胞器。虽然对这种效应的进一步机械理解可能是可取的，也是未来研究的目标，但对于本工作的范围而言，重要的是使用二聚体系统，我们的两个膜相关的浓缩膜样细胞器在同一细胞内按设计发挥作用，并且相互正交。（F） 在这些实验中，400 ng报告基因和tRNA质粒与100 ng OT细胞器构建物和300 ng模拟质粒共同转染。在存在基于MCP的OT细胞器时，mCherry表达占优势，而在存在λN22气体-基于OT细胞器，主要产生全长EGFP。（G） 条形图类似于（B）中的条形图，对应于面板F中的条件，并归一化为细胞质GCE系统（参见面板a）。对于（B，D，G）未转染细胞的分析，未考虑（由相应FFC点图左下象限所示的最小EGFP/mCherry荧光水平确定）。所有条形图显示了所有实验的平均值；误差条代表SD。
图5
图5
在同一真核细胞内创建多个完全正交的GCE系统（A）二聚体OT膜样细胞器和FFC分析的示意图概述。（B） 表达双招募报告基因（EGFP）的HEK293T细胞的FFC分析39标签：：方框B，mCherry190标签：：ms2）和tRNA派尔以及优化的GCE系统。实验是在所示的ncAA存在的情况下进行的。显示了四个独立实验的总和。（C） 条形图显示了与（B）中的条件相对应的mCherry信号与EGFP信号的比率，并归一化为细胞质GCE系统（见图S7A）。比率显示在对数刻度上；正对数表示mCherry的表达高于EGFP；负对数比率对应于EGFP超过mCherry；接近零的比率表示EGFP和mCherry荧光水平相似。在本分析中，未考虑未转染细胞（由B左下象限所示的最小EGFP/mCherry荧光水平确定）。显示了所有实验的平均值；误差条代表SD。（D）IF染色针对MCP和λ第22页对应于（A）-（C）中的条件。在所有系统的预期位置观察到二聚OT膜样细胞器。自上而下：MCP，λN22气体、mCherry、EGFP和合并（黄色MCP，λN22气体蓝色为mCherry（洋红），绿色为EGFP（绿色）。比例尺，20μm。（E） 表达双标记成像报告基因（Nup153:：EGFP）的HEK293T细胞149标签：：方框B，H2B:：m樱桃190标签：：ms2）与tRNA一起派尔以及优化的GCE系统。实验是在（B）中FFC数据的成像结果表明并证实存在ncAA的情况下进行的。比例尺，20μm。
图6
图6
通过膜状细胞器结合不同的ncAA可以在细胞中进行特定的生物正交蛋白质标记（A和B）预期反应的示意图概述。来自3-IF和TCO的混合∗A-K，仅TCO∗A-K可以与H-Tet-SiR反应。类似地，在另一个实验中，从SCO-Y和Cbz-K的混合物中，只有SCO-Y可以反应（B）。（C–F）双重标记成像报告（Nup153:：EGFP149标签：：方框B，H2B:：m樱桃190标签：：ms2）与tRNA一起表达派尔以及一个指定的优化GCE系统，存在指定的ncAA。上图所示的卡通描绘了预期结果。自上而下：EGFP、mCherry、SiR和合并频道。H-Tet-SiR的使用浓度为200 nM（C–E）或1μM（F）。根据每种情况的最大能见度调整对比度。比例尺，10μm。
图7
图7
OT膜状细胞器形成了薄的翻译微环境，有效地为细胞配备了两个扩展的遗传密码。细胞内独立蛋白质翻译微环境的示意图。在这里，薄膜状细胞器安装在PM或ERM上，琥珀色密码子被重新分配给选定蛋白质的特定ncAA（X）。同时，第二个OT膜状细胞器安装在OMM上，将琥珀色密码子重新分配给第二个ncAA（Y）。同时，翻译在细胞质中进行，一旦核糖体遇到琥珀色密码子，翻译就终止。
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中的注释

  • 膜状细胞器使细胞具有多种遗传密码。
    Taylor NC，Nikić-Spiegel I。 Taylor NC等人。 生物化学科学趋势。2022年5月；47(5):369-371. doi:10.1016/j.tibs.2021.11.006。Epub 2021年12月9日。 生物化学科学趋势。2022 PMID：34895957

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