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.2022年7月；13(7):490-512.
doi:10.1007/s13238-021-00864-5。 Epub 2021年7月31日。

LIN28协同促进多能干细胞的核仁/核糖体功能并抑制2C类转录程序

甄孙 # 1, 华语 # 1, 赵静（音译） # 1, 谭天宇 1, 潘洪如 1, 朱玉清 1, 郎晨 1, Cheng Zhang（张成） 2, 李章 1, 安华磊 1, 徐玉燕 1, 仙居碧 三, 黄欣 4, 博高 5, 王龙飞 6 7, 克里斯蒂娜·科雷亚 2, 陈明 8, 孙启明 9, 于峰 5, 李深 10, 郝武 6, 王建龙 4, 申晓华 三, 乔治·戴利 7, 胡丽 2, 金章（Jin Zhang） 11 12 13
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LIN28协同促进多能干细胞的核仁/核糖体功能并抑制2C类转录程序

甄孙等人。 蛋白质细胞. 2022年7月.

摘要

LIN28是一种RNA结合蛋白，在早期胚胎发育、干细胞分化/重编程、肿瘤发生和代谢中发挥重要作用。以前的研究主要集中在它在细胞溶质中的作用，在细胞溶液中它与Let-7 microRNA前体或mRNA相互作用，很少有研究涉及LIN28在细胞核中的作用。在这里，我们发现LIN28在小鼠胚胎发育过程中表现出动态的时间和空间表达。母体LIN28的表达在退出2细胞期时下降，而合子LIN28蛋白在4细胞到胚泡期的发育过程中在形成核仁处被诱导，在着床后在细胞质中主要表达。在培养的多能干细胞（PSCs）中，LIN28的缺失导致核仁应激和激活以内源性逆转录病毒基因表达为特征的2细胞/4细胞样转录程序。从机械上讲，LIN28与小核仁RNA和rRNA结合以维持核仁完整性，其丢失导致核仁相分离缺陷、核糖体应激和P53活化，而P53又与2C转录因子Dux结合并激活。LIN28还存在于含有核仁因子核仁蛋白（NCL）和转录抑制因子TRIM28的复合体中，LIN28的缺失导致NCL/TRIM28复合体在Dux和rDNA位点上的占有率降低，从而使Dux失表达，rRNA表达降低。带有核仁应激的Lin28敲除细胞更可能呈现缓慢循环、翻译惰性和合成代谢不活跃状态，这是以前未被认可的2C类转录程序的一部分。这些发现阐明了核仁LIN28在PSC中的新作用，以及在PSC和早期胚胎发育中连接2C程序和核仁功能的新机制。

关键词：2-细胞样程序；LIN28；NCL/TRIM28复合体；核仁完整性。

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数字

图1
图1
LIN28A在小鼠早期胚胎发育及不同状态多能干细胞中的时空表达.（A）mRNA表达林28a和阶段特异性标记基因Yap1号机组（卵母细胞），Zscan4d公司（2C）和纳克根据已发布的RNA-seq数据分析了不同发育阶段的（胚泡内细胞质量）（Wang等人，2018）。MII：中期II。TPM：mRNA表达水平的百万分转录本。R： 右y轴。括号中的数字表示胚胎数量。（B） 小鼠植入前胚胎发育早期LIN28A和核仁标记蛋白纤维蛋白（FBL）的免疫荧光染色。2PN：双原核期。BC：囊胚期。比例尺，50μm。（C） 上面板：原始和启动的多能干细胞中具有代表性的Lin28A免疫染色。下部面板：主要在细胞核中含有LIN28A的细胞百分比汇总。细胞作为单个细胞生长，或在小菌落中生长，并分别计数。图中的每个点代表每个条件下大约10个细胞的一次计数实验。比例尺，10μm**对< 0.01, ***对< 0.001,t吨-测试，误差栏：平均值的标准误差。（D和E）免疫荧光染色和共聚焦（使用Airyscan模块）显示LIN28A亚细胞定位和核仁室标记蛋白，如核蛋白（NPM1，颗粒组分）、纤维素酶（FBL，致密纤维组分）和Pol I（RPA194，纤维中心）。直方图表示每个蛋白质沿箭头栏的信号强度。比例尺，10μm
图2
图2
LIN28缺乏导致ERV和2C标记基因激活（A）比较野生型和林28a敲除ES细胞。（B） 胚胎期特异性基因根据其表达模式分为五类。（C） 日志2基因表达丰度在林28a敲除每个基因簇的ES细胞和野生型细胞***对<0.001，Mann-Whitney U检验。（D） 中不同类别的长末端重复或LTR表达林28a和林28b敲除ES细胞。（E） ERVL基因的两个亚类MERVL-int和MT2_Mm在林28a敲除ES细胞。对于（D和E），LTR表达的TPM值在所有样本中线性归一化为0到1的范围***对<0.001，Wilcox符号秩检验。所选2C标记基因和Mervl-聚合酶基因的（F和G）qPCR验证(Mervl-pol公司)野生型和林28a/b敲除ES细胞。（H和I）LIN28A在敲除细胞中的过度表达逆转了2C基因和ERV基因的激活。（J） 显微镜照片和流式细胞术显示了使用转染有2C:：td番茄记者结构。（K） 野生型和林28a敲除ES细胞*对< 0.05, **对< 0.01, ***对<0.001，双向方差分析，n个=3，误差栏：平均值的标准误差
图3
图3
LIN28通过抑制 杜克斯（A和B）UCSC基因组浏览器视图，显示所示ES细胞（A）或iPS细胞（B）中Dux基因的RNA-seq结果。（C） ATAC-seq轨道位于杜克斯宽型（蓝色）和Lin28a敲除（棕色）ES细胞的家族基因座。（D） qRT-PCR显示杜克斯用空载体或Lin28a过表达载体转导的野生型和双敲除iPS细胞中的基因表达（相对表达标准化为Gapdh）。（E） 箱线图显示，通过分析Lin28双敲除iPS细胞中上调的基因，Dux靶点比非靶点更容易诱导。（F） qRT-PCR显示杜克斯野生型和Lin28双敲除iPS细胞中，2C基因和MERVL的表达杜克斯siRNA。（G） ChIP-qPCR显示H3K9me3水平杜克斯野生型和敲除型ES细胞的基因位点。IgG作为对照。（H） UCSC基因组浏览器查看H3K9me3 ChIP-seq结果杜克斯家庭*对< 0.05, **对< 0.01, ***对<0.001，双向方差分析，n个=3，误差栏：平均值的标准误差
图4
图4
LIN28与snoRNA和rRNA结合，其丢失导致rRNA生物生成减少和核糖体应激（A）LIN28A CLIP-seq富集分析。与其他基因相比，ERVL、MERVL-int和MT2_Mm类在LIN28A结合靶点中没有富集。（B） qRT-PCR显示rRNA在野生型和林28a敲除ES细胞。PCAGIG：空向量。OE：过度表达*对< 0.05, **对< 0.01, ***对<0.001，双向方差分析，n个=3，误差栏：平均值的标准误差。（C） GSEA分析显示核糖体基因集的集体变化林28a与野生型细胞相比，敲除ES细胞。NES：标准化浓缩分数。（D） 流式细胞术显示OP-puromycin（OP-puro）标记野生型和林28a敲除ES细胞。（E） 电镜显示野生型和林28a敲除ES细胞。比例尺，2μm。（F） 左侧面板：GSEA分析显示p53信号通路基因集的集体变化。右侧面板：上调p53靶基因林28a与野生型细胞相比，敲除ES细胞。（G–I）qRT-PCR显示杜克斯（G） 、2C相关基因（H）或MERVL（I）在野生型和林28a用干扰阴性对照处理的敲除ES细胞，或Trp53基因siRNA。（J和K）qRT-PCR显示杜克斯（J） 或用4μmol/L CX-5461或等量水（对照）处理12小时的ES细胞中的2C相关基因（K），或Trp53基因在相同条件下处理的敲除ES细胞。（五十） UCSC基因组浏览器使用p53抗体和磷酸化p53 S18P查看ChIP-seq结果杜克斯基因位点*对< 0.05, **对< 0.01, ***对<0.001，双向方差分析，n个=3，误差栏：平均值的标准误差
图5
图5
LIN28A与核仁蛋白相关，并通过NCL/TRIM28复合物介导rRNA生物发生和2C基因抑制（A）维恩图，显示LIN28A拉下的蛋白质与核仁蛋白质或核糖体蛋白质之间的重叠。（B） 通过Co-IP验证内源性LIN28A和核仁或核蛋白之间的相互作用，然后在ES细胞中进行Western blot分析。IgG被用作IP的阴性对照。（C） 野生型和野生型中NCL和FBL的RIP-qPCR测定林28a敲除ES细胞*对< 0.05, **对< 0.01, ***对<0.001，双向方差分析，n个=3，误差栏：平均值的标准误差。（D） RiboMethseq对野生型和林28a敲除ES细胞。MethScore是使用（Birkedal等人，；Marchand等人，2016）中提到的方法计算的***对< 0.001. 威尔科克斯签署了等级测试。（E） 左侧面板：RiboMeth-seq显示28s rRNA上一系列snoRNA靶向区域（从3366 bp到3397 bp）的映射测序结果。红色突出显示的A是预测的甲基化位点（来自SnoRNA Orthological Gene Database）。右侧面板，计算RiboMeth-Seq得分，以指示A预测位点的2'-O-甲基化水平（Birkedal等人，2015）。（F） 蛋白质组学分析显示野生型和林28a敲除ES细胞***对< 0.001,t吨-测试，n个=3，误差栏：平均值的标准误差。（G） 蛋白质组学分析显示野生型和第28行敲除细胞（平均蛋白质组数据来自林28a敲除ES细胞和林28a/b条敲除iPS细胞）。误差栏：平均值的标准误差。n个=2个独立的蛋白质组学实验。（H和I）qRT-PCR显示2C相关基因在用干扰阴性对照或指示的siRNAs处理的ES细胞中的表达。（J和K）NCL和TRIM28 ChIP-qPCR分析杜克斯（J） 和rRNA（K）基因座林28a敲除ES细胞。（五十） p53和TRIM28 ChIP-qPCR分析杜克斯未经处理和CX-5461处理的ES细胞中的基因座
图6
图6
LIN28的缺失改变了2-细胞/ES的稳态，并导致RP表达更低和翻译惰性的2C样细胞（A）GSEA分析2C:：td番茄+ES细胞与2C:：td番茄-指定基因集的细胞。（B） tSNE图显示野生型和林28a将敲除的ES细胞放在一起。（C） tSNE图显示与（B）中相同细胞的平均核糖体蛋白（RP）基因表达和ERV基因表达。颜色强度表示单个细胞中ERV基因或核糖体蛋白基因的平均表达。（D） 散点图显示了野生型和野生型中MERVL-int或MT2_Mm表达与单细胞RNA-seq核糖体基因表达之间的相关性林28a敲除细胞。每个点代表一个具有可检测ERV表达的单个细胞。（E） tSNE图显示野生型和林28a分别敲除ES细胞。颜色强度表示单个细胞中ERV基因或核糖体蛋白基因的平均表达
图7
图7
LIN28在植入前胚胎发育过程中促进蛋白质合成并促进2C基因阻遏s.（A）在（B）、（C）、（E–I）（B）qRT-PCR中siRNA微注射实验的示意图，显示林28a受精卵注射siRNAs后囊胚中的mRNA水平在体外注射胚胎的培养。A类林28a用siRNA池敲除胚胎中的Lin28a基因，用打乱的siRNA双链作为阴性对照（siNC）*对< 0.05,t吨-测试，误差栏：平均值的标准误差。（C） LIN28A的胚胎免疫染色显示LIN28A敲除成功。该图像代表了三个独立实验中的一个。比例尺，50μm。（D） 受精卵注射林28asiRNA池或对照siRNA。（E）荧光成像显示OP-puromycin标记的（1小时）培养胚胎在体外在不同的阶段。比例尺，50μm。（F） 对照组和对照组OP-puromycin标记（1 h）和LIN28A表达免疫染色第28行敲除桑椹胚阶段的胚胎。比例尺，50μm*对< 0.05,t吨-测试，误差栏：平均值的标准误差。（G） qRT-PCR显示受精卵注射siRNAs后2C相关基因在囊胚中的表达在体外培养这些胚胎*对< 0.05, **对< 0.01, ***对<0.001，双向方差分析，n个=3，误差栏：平均值的标准误差。（H） 日志2基因表达丰度在林28a图2B中描述的每个基因簇的敲除和对照胚胎*对< 0.05, ***对<0.001，Mann-Whitney U检验。（一） 两个亚类MERVL基因MERVL-int和MT2_Mm在林28a敲除和控制胚胎***对<0.001，Wilcox符号秩检验。（J） GSEA分析显示核糖体基因集的集体变化林28a敲除和控制胚胎。NES：标准化浓缩分数
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参考文献

    1. Baker CL，Pera MF。捕获全能干细胞。细胞干细胞。2018;22:25–34. doi:10.1016/j.stem.2017.12.011。-内政部-公共医学
    1. Biggiogera M，Burki K，Kaufmann SH，Shaper JH，Gas N，Amalric F，Fakan S.通过免疫电子显微镜观察小鼠植入前胚胎中蛋白质B23和核仁蛋白的核仁分布。发展。1990;110:1263–1270. doi:10.1242/dev.110.4.1263。-内政部-公共医学
    1. Birkedal U，Christensen-Dalsgaard M，Krogh N，Sabarinathan R，Gorodkin J，Nielsen H.通过高通量测序分析RNA中的核糖甲基化。Angew Chem国际教育英语。2015;54:451–455.-公共医学
    1. Bolger AM，Marc L，Bjoern U.Trimmomatic：Illumina序列数据的灵活修剪器。生物信息学。2014;30:2114–2120. doi:10.1093/bioinformatics/btu170。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Borsos M，Torres-Padilla ME。构建细胞核：哺乳动物发育过程中建立全能性和多能性的核组织。基因开发2016；30:611–621. doi:10.1101/gad.273805.115。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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