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.2021年6月16日；13(6):892.
doi:10.3390/药剂学13060892。

用于药物发现早期高通量筛选化合物的体外人脑血屏障模型的小型化和自动化

Elisa L J Moya女士 1, 埃洛迪·范登哈特 2, Eleonora Rizzi公司 1, 玛丽·克里斯汀·布考尔 1, 约翰·哈查尼 1, 纳撒利·莫邦 2, 法比安·戈塞莱 1, 玛丽·皮埃尔·德胡克 1
附属公司

用于药物发现早期高通量筛选化合物的体外人脑血屏障模型的小型化和自动化

Elisa L J Moya女士等。 药剂学. .

摘要

中枢神经系统（CNS）疾病是全球死亡的主要原因之一。由于血脑屏障（BBB）的存在，药物难以渗入大脑，许多中枢神经系统药物治疗在临床试验中失败。因此，有必要在药物发现过程中尽早更好地选择有效的中枢神经系统药物，从而按照向大脑递送的策略开发有效的药物。体外BBB模型的使用已被证明有助于评估药物/化合物毒性、BBB渗透速率和脑细胞内分子转运机制在学术研究和早期药物发现中的影响。然而，这些需要生物材料（动物大脑或人类细胞）的研究是耗时的，并且由于模型的形式，涉及昂贵的材料和塑料废料。因此，为了适应化合物筛选的早期药物发现所需的高产量，一种已获得专利的成熟的体外人血脑屏障模型被微型化并自动化为96-well格式。该复制符合所有BBB模型的可靠性标准，以获得预测结果，从而显著减少了生物材料、废物，并提高了在早期药物发现研究中广泛使用的筛选能力。

关键词：BBB渗透率；中枢神经系统药物筛选；自动化系统；血脑屏障；脑递送；体外模型；筛选分析。

PubMed免责声明

利益冲突声明

E.V.和N.M.是HCS Pharma的员工。E.V.和N.M.为研究设计和数据收集做出了贡献。E.V.监督手稿。该公司没有参与研究设计；收集、分析或解释数据；在撰写手稿时，或在决定公布结果时。其他作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
细胞培养过程的示意图，以使用从人类造血干细胞和牛脑周细胞衍生的内皮细胞（EC）开发非接触性共培养人玻璃体BBB模型。将细胞在培养皿中解冻，并使其生长2天。然后，通过在过滤器中植入人类内皮细胞，在底部隔室中植入脑周细胞，以实现12孔板或微型96太瓦系统的共培养。在2次培养基更换（MC）后，在共培养的第6天进行实验，以获得BBB表型。详细说明了培养基的体积以及培养板的类型和数量。使用创建的图像BioRender.com网站（2021年4月15日访问）。
图2
图2
细胞接种密度对小型血脑屏障模型开发的适应性。内皮细胞（EC）接种在插入系统的过滤器上，周细胞（PC）接种在不同密度的底部微孔中。(A类)通过Pe的比较对不同96孔系统板的人工细胞播种密度比测试氟化钠系数被用作模型的完整性标记，从用作对照的12太瓦BBB模型中获得(n个=3个复制品）和小型化系统。使用普通的单因素方差分析和多重比较检验进行统计分析。显著差异是**第页-值<0.01，ns=无显著差异。Falcon板手细胞播种密度比试验，n个=8个重复；康宁板，n个=6次重复。(B类)细胞播种自动化测试的验证。与手动播种相比，机器人自动播种的Falcon板在EC完整性方面没有显著差异（ns）。康宁平板根据细胞播种类型显示出显著差异：18000/15000和26000/15000（ECs/PC）*第页-值<0.05，无显著差异（ns，第页=0.109），对于自动细胞播种率22000/15000（ECs/PC），n个=8次重复。统计分析是多重的t吨-测试。
图3
图3
共焦显微镜下内皮细胞可视化的示意图。在最初的12太瓦模型中，过滤器被切割并放置在盖玻片中，然后返回以获取EC管腔面上的图片。如果将小型系统的滤光片直接放置在为显微镜开发和改装的3D框架上，避免了底部隔间的需要，降低了穿过两个隔间的透镜高度，则通过滤光片从透明EC表面拍摄照片。使用创建的图像BioRender.com网站（2021年4月15日访问）。
图4
图4
RT-qPCR基因表达分析。原始12太瓦模型（灰条）和微型96太瓦系统（蓝条）的流出和流入转运蛋白、大分子受体和紧密连接的剖面研究比较。样品为n个=9英寸N个=3（LRP1除外：n个=6和N个= 2). RPLP0的相对规范化表达式。平均值±扫描电镜倍数t吨-测试显示P-gP无显著差异(第页=0.261），BCRP(第页=0.988），MRP1(第页=0.126），MRP4(第页=0.548），MRP5(第页=0.988），MCT1(第页=0.988），GLUT1(第页=0.410），低密度脂蛋白(第页=0.422），T-fR(第页=0.988），LRP1(第页=0.988），LRP8(第页=0.988），SCARB1(第页=0.732），CLDN5(第页=0.988）和OCLN(第页=0.176），RAGE基因表达除外(*第页= 0.0120).
图5
图5
原始12太瓦模型和微型96太瓦系统之间的BBB表型比较。(A类)内皮通透性系数（Pe，单位为cm/min）测量荧光素钠（NaF）通过原12TW模型和不同细胞接种系列的微型96TW系统中BLEC的传输。结果显示在原始12 TW模型的散点图中：n个= 57,N个=19和96 TW系统：n个= 194,N个=22（未配对t吨-测试；ns=无显著差异）。(B类)免疫细胞化学CD34+-通过连接蛋白（绿色）的表达验证ECs BBB表型：VE钙粘蛋白、PECAM（CD31+)，闭塞带-1和Claudin-5。原子核是蓝色的。最初的12个TW图像是从管腔BLEC面部拍摄的，而96个TW系统中的图像是使用ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging system（物镜20×（比例尺=25µm）从管腔的BLEC面部采集的。(C类)外排泵功能评估。在原始模型和小型模型中，在存在或不存在抑制剂Elacridar（GF）的情况下，BLEC中R123细胞内积累的百分比。样品：n个= 9,N个=3（倍数t吨-测试*第页-值<0.05）。
图6
图6
小型化和自动化人血脑屏障体外模型的筛选应用。(A类)Friden M等人2009年获得的人类脑脊液/血浆（体内Kp、uu、CSF）未结合分数比率的值（平均值±SD）。通过96 TW小型化和自动化人体模型在体外（体外Kp、uu、大脑）预测脑/血浆的未结合分数比率。通过质谱法（LC-MS/MS系统）检测浓度，并计算回收的未结合分子总量（回收率，以百分比表示）。(B类)Kp、uu、CSF与Kp、uu、大脑非线性方程的相关性；对2=0.808；n个= 3;N个= 1.
图7
图7
BBB通过浓度的复合影响。一组无毒（L-抗坏血酸）、有毒但无神经毒性的化合物（对乙酰氨基酚和曲格列酮）和神经毒性化合物（三苯氧胺和鱼藤酮）在共培养基中培养24小时；BBB完整性标记NaF（Pe）的渗透系数氟化钠)进行了评估。样品：n个= 2,N个= 2.
图8
图8
受体功能和内吞途径抑制。荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白（acLDL）暴露于ATP合成抑制剂（FCCP）、小窝蛋白（染料木素）和氯氰菊酯介导的细胞转化（氯丙嗪）和大胞吞（二甲基氨氯）途径的抑制剂。当存在FCCP和氯丙嗪时，BLEC内AcLDL摄取减少，表明受体的功能性。ImageXpress微共焦高内容成像系统拍摄的图像，物镜20×（比例尺=25µm）。
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