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.2021年7月；35（7）：e21728。
doi:10.1096/fj.202100381RR。

PFKFB3依赖性葡萄糖代谢调节3T3-L1脂肪细胞发育

贝丝·A·格里塞尔 1, 松崎佐治 2, 阿尔伯特·巴图桑斯基 2, 蒂莫西·格里芬 1 2, 肯尼斯·汉弗莱斯 1 2, 安·路易斯·奥尔森 1
附属公司

PFKFB3依赖性葡萄糖代谢调节3T3-L1脂肪细胞发育

贝丝·A·格里塞尔等。 美国财务会计准则委员会J. 2021年7月.

摘要

前脂肪细胞和其他细胞类型的增殖和分化伴随着葡萄糖摄取的增加。先前的研究表明，在体外分化的前3天需要高糖脉冲，但之后就不需要了。脂肪细胞分化所需的特定葡萄糖代谢途径尚不清楚。在此，我们使用3T3-L1脂肪细胞作为模型系统，研究分化前3天内的葡萄糖代谢和脂肪细胞代谢组的膨胀。我们的主要结果指标是GLUT4和脂联素，这是与健康脂肪细胞相关的关键蛋白。使用含0或5 mM葡萄糖的完整培养基，我们区分了依赖于地塞米松、胰岛素和异丁基甲基黄嘌呤单独或鸡尾酒加葡萄糖的分化鸡尾酒的发育特征。鸡尾酒足以激活2-脱氧葡萄糖摄取和糖酵解能力，但不能支持成熟脂肪细胞中GLUT4和脂联素的表达。相反，培养基中的5 mM葡萄糖促进葡萄糖摄取和糖酵解的瞬时增加，以及脂肪细胞代谢组和蛋白质组的显著扩张。使用遗传和药理学方法，我们发现5 mM葡萄糖对脂肪细胞分化的积极作用是由于6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3（PFKFB3）的表达增加，PFKFB是糖酵解的关键调节因子，也是辅助的葡萄糖代谢途径。我们的数据揭示了PFKFB3活性在调节脂肪细胞分化和成熟所需的细胞代谢重塑中的关键作用。

关键词：脂肪生成；脂联素；糖代谢；葡萄糖转运；葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）；磷酸果糖激酶果糖双磷酸酶3（PFKFB3）。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

作者声明，他们与本文的内容没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
3T3-L1脂肪细胞成熟需要葡萄糖和葡萄糖代谢。A） 分化前3天在含有0或5 mM葡萄糖和0或2 mM谷氨酰胺的培养基中分化的细胞裂解物的免疫印迹。所有细胞都被切换到培养基中，加上5 mM葡萄糖和2 mM葡萄糖，第4天到第6天，并在第6天收获。用所示抗体对培养基和细胞裂解物进行免疫标记，并显示n=3个独立试验的代表性印迹。B） 量化n=3个独立实验。字母“a”表示与0 mM葡萄糖和0 mM谷氨酰胺相比，单因素方差分析和Dunnett的多重比较试验存在显著差异（p<0.001）。C） 在含有0 mM或5 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺的培养基中分化的第0天（前脂肪细胞）、第1天、第2天和第3天3T3-L1脂肪细胞的2-脱氧葡萄糖摄取、D）ATP浓度和E）总蛋白。用不同字母标记的直方图表示与所有其他条件的统计差异（n=5次重复）（p<0.01）。数据采用双向方差分析和Tukey的事后检验进行分析。F） 糖酵解应激试验测量分化后第0天（前脂肪细胞）、第1天、第2天和第3天在补充有5 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺的培养基中的细胞外酸化率（ECAR）。第一张图显示了酸化实验的轨迹，并标记了添加物，第二张图分别显示了非糖酵解酸化、糖酵化和糖酵分解能力曲线下面积的量化。字母“a”表示与前脂肪细胞压力测试相应成分相比的统计差异。数据通过单因素方差分析和Dunnett的多重比较检验进行分析（p<0.01）。G） 在补充0 mM或5 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺的培养基中分化的第3天脂肪细胞中氨基酸（A丙氨酸、C半胱氨酸、W色氨酸、P脯氨酸、T苏氨酸、S丝氨酸、Y酪氨酸、I异亮氨酸、F苯丙氨酸、L亮氨酸、V缬氨酸、G甘氨酸、E谷氨酸、D天冬氨酸）的相对浓度比率。该比率是根据每个条件下n=4次重复的平均值得出的。*使用方法中所述的多个Student t检验表明，当比率与单位显著不同时（p<0.001）。H） 第3天用0 mM或5 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺分化的脂肪细胞中的关键有机酸，乳酸（Lac）、柠檬酸（Cit）、α-酮戊二酸（α-KG）、富马酸（Fum）、苹果酸（mal）和琥珀酸（Suc）。使用方法中所述的错误发现率校正，通过Student t检验分析条件（n=3）之间的相对差异，并显示q值。
图2。
图2。
关键糖酵解代谢产物的葡萄糖和激素依赖性表达。A） 在分化后第0天（前脂肪细胞）、第1天、第2天或第3天采集在0 mM或5 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺中分化的3T3-L1细胞。如图所示，对细胞裂解物进行免疫标记。B） 量化n=3个独立实验。通过双向方差分析和Tukey的事后检验确定天数和条件之间的统计差异。显示了p值。C） 在添加或不添加分化激素混合物（DII）的补充有0 mM 5 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺的培养基中，测定分化后第3天细胞外酸化率（ECAR）的糖酵解应激试验。第一张图显示了酸化实验的轨迹，并标记了添加物，第二张图分别显示了非糖酵解酸化、糖酵化和糖酵分解能力曲线下面积的量化。字母表示与无DII的0 mM葡萄糖细胞应激试验的相应成分相比的统计差异。通过单向方差分析和Tukey事后检验分析数据（p<0.01）。
图3。
图3。
葡萄糖摄取和糖酵解在分化第3天短暂上调。A） 在含有5 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺的培养基中分化出第0天（前脂肪细胞）、第3天和第6天3T3-L1脂肪细胞的2-脱氧葡萄糖摄取、B）ATP浓度和C）总蛋白。统计差异（n=3个重复）是单向方差分析和Tukey的事后检验。D） 糖酵解应激试验测量分化后第3天和第6天的细胞外酸化率（ECAR），如上所述。第一张图显示了酸化实验的轨迹，并标记了添加物，第二张图分别显示了非糖酵解酸化、糖酵化和糖酵分解能力曲线下面积的量化。使用Student t检验比较第3天和第6天（n=5次重复）压力测试各组成部分的差异，并用字母“a”表示（p<0.01）。E） 分化后第3天和第6天调节细胞糖酵解的关键蛋白的免疫印迹分析。F） 量化n=3个独立实验第6天/第3天关键蛋白的表达比率。将每个蛋白质的比率与我们的负荷控制微管蛋白的比率进行比较。给出了不同于微管蛋白的比率的p值。
图4。
图4。
PFKFB3基因敲除抑制葡萄糖摄取和脂肪细胞成熟。A） 3T3-L1细胞分化前3天糖酵解关键调控因子的示意性总结。B） 在分化第1天（在5 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺中）用PFKFB3 siRNA或打乱（Sc）siRNA转染脂肪细胞至第3天。对裂解液进行PFKFB3和微管蛋白免疫标记。B） 所示3个重复的相对密度测定。D） 在第1天转染PFKFB3 siRNA或Sc siRNA的第3天脂肪细胞的基础2-脱氧葡萄糖摄取。使用Student t检验对n=6个重复进行分析。E） 第1天，在补充有5 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺的培养基中分化的3T3-L1脂肪细胞，并转染PFKFB3 siRNA或Sc siRNA。如图F）免疫印迹定量，对裂解液和培养基进行免疫印迹。使用Student t检验确定差异，并显示p值。
图5。
图5。
在D期最后39小时内慢性抑制PFKFB3阻止脂肪细胞成熟。A） 实验设计的示意图。B） 如图所示，在添加0或5 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺的培养基中分化的3T3-L1细胞用AZ67处理。在分化后第6天制备细胞裂解物，并按照指示对裂解物和培养基进行免疫印迹。C） 使用Tukey的事后检验，通过单向方差分析对n=3个独立实验的免疫印迹定量进行分析，以比较不同AZ67脉冲下的5 mM葡萄糖，显示p值。D） 如图所示，在添加0或5 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺的培养基中分化的3T3-L1细胞用AZ67处理。在分化后第6天制备细胞裂解物，并按照指示对裂解物和培养基进行免疫印迹。E） 使用Tukey的事后检验，通过单向方差分析对n=3个独立实验的免疫印迹定量进行分析，以比较不同AZ67脉冲下的5 mM葡萄糖。用不同字母标记的直方图与给定免疫标记的所有其他条件显著不同。F） 用含有5 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺的培养基分化第3天脂肪细胞，并用AZ67处理，其2-脱氧葡萄糖摄取、G）ATP和H）总蛋白。采用单因素方差分析和tukey事后检验对n=6个独立复制进行分析。一） 如F-H所述，在第3天脂肪细胞中进行糖酵解应激试验。第一张图显示了酸化试验的轨迹，并标记了添加剂，第二张图显示非糖酵化酸化、糖酵分解和糖酵水解能力曲线下面积的量化。字母表示与压力测试相应部分相比的统计差异。通过单向方差分析和Tukey事后检验分析数据（p<0.01）。H） 如F-H所述，第3天分化脂肪细胞中的关键代谢产物。通过多重t检验确定差异。J） 第3天用5 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺分化的脂肪细胞中的关键有机酸，乳酸（Lac）、丙酮酸（Pyr）、柠檬酸（Cit）、富马酸（Fum）、苹果酸（mal）和琥珀酸（Suc），并用AZ67脉冲B方案处理。使用方法中描述的错误发现率校正，通过Student t检验分析条件（n=5）之间的相对差异，并显示q值。
图6。
图6。
抑制戊糖磷酸途径抑制脂肪细胞成熟。A） 实验设计的示意图。B） 如图所示，在添加0或5 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺的培养基中分化的3T3-L1细胞用6-AN处理。在分化后第6天制备细胞裂解物，并按照指示对裂解物和培养基进行免疫印迹。C） 使用Tukey的事后检验，通过单向方差分析对n=3个独立实验的免疫印迹定量进行分析，以比较不同AZ67脉冲下的5 mM葡萄糖，显示p值。D） 如图所示，在添加5 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺的培养基中分化的3T3-L1细胞用6-AN处理。在分化后第6天制备细胞裂解物，并按照指示对裂解物和培养基进行免疫标记。E） 使用Tukey的事后检验，通过单向方差分析对n=3个独立实验的免疫印迹定量进行分析，以比较不同6-AN脉冲下的5 mM葡萄糖。用不同字母标记的直方图与给定免疫标签的所有其他条件显著不同。
图7。
图7。
在D期的最后39小时内，PFKFB3的慢性抑制阻止了腹股沟原代前脂肪细胞的脂肪细胞成熟。A） 实验设计的示意图。B） 在补充5 mM葡萄糖的培养基中分化腹股沟脂肪组织前脂肪细胞，如图所示，用AZ67处理2 mM谷氨酰胺。在分化后第0天、第3天和第6天制备细胞裂解物，并按照指示对裂解物和培养基进行免疫印迹。C） 采用Tukey的事后检验，通过单向方差分析对n=3独立实验的免疫印迹定量进行分析，以比较对照细胞和AZ67处理细胞随时间的变化。用字母“a”表示的条形图表示与第0天的细胞相比有显著差异（p<0.01）。字母“b”表示对照细胞和AZ67细胞之间的显著差异（p<0.01）。
图8。
图8。
PFKFB3活性调节成熟脂肪细胞功能。A） 对前48小时未使用或使用30μM AZ67处理的第6天脂肪细胞的指示蛋白质进行免疫印迹分析。B） 通过Student t检验分析n=3个独立实验的免疫印迹定量。C） 前48小时未使用或使用30μM AZ67处理的第6天脂肪细胞的油红O染色。数据表示为油红O/结晶紫洗脱液的吸光度比。来自n=6个独立重复的数据通过Student t检验进行分析。
图9。
图9。
PFKFB3的表达依赖于禁食/再喂养周期。A） 禁食和4小时参考附睾（EPI）和腹股沟皮下脂肪（SQ）细胞裂解物的免疫印迹分析。B） 显示了n=4个独立实验的量化。使用Student t检验分析了EPI禁食和SQ禁食之间的差异。C） 禁食和4小时参考雄性小鼠的PFKFB3 mRNA，n=4到10个重复。使用Student t检验分析了EPI禁食和SQ禁食之间的差异。
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