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.2021年3月31日；11(12):5831-5846.
doi:10.7150/thno.55574。 eCollection 2021年。

柴胡皂苷D通过靶向FTO/m发挥抗白血病活性6A信号

孙凯菊 1, 杜阳阳 2, 侯玉柱 1, 赵明月 1, 李佳佳 三, 杜亚哲 4, 张凌霄 2, 陈昌宝 1, 杨红梅 1, 费燕 2, 瑞苏（Rui Su） 1
附属机构

柴胡皂苷D通过靶向FTO/m发挥抗白血病活性6A信号

孙凯菊等人。 治疗诊断科技. .

摘要

目的：急性髓细胞白血病（AML）靶向治疗的实施一直具有挑战性。脂肪质量和肥胖相关蛋白（FTO），mRNA N6-甲基腺苷（m6A） 去甲基化酶作为一种癌基因发挥作用，促进白血病癌基因介导的细胞转化和白血病发生。在此，我们研究了Saikosaponin-d（SsD）在AML广泛抗增殖作用中的作用，并评估了其在AML中的作用6通过靶向SsD的FTO的去甲基化活性。方法：研究了SsD是否以及如何调节FTO/m6AML中的信号。SsD的药理活性及其作用机制在体外在小鼠中，测定了原代患者细胞和酪氨酸激酶抑制剂耐药细胞。结果：SsD广泛抑制AML细胞增殖，促进细胞凋亡和细胞周期阻滞在体外和体内在机械方面，SsD直接瞄准了FTO，从而增加了全球市场份额6RNA甲基化反过来降低下游基因转录物的稳定性，导致相关通路受到抑制。重要的是，SsD还克服了FTO/m6A介导的白血病对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性。结论：我们的研究结果表明，FTO依赖性m6RNA甲基化介导了SsD的抗白血病作用，从而打开了将SsD开发为用于白血病治疗的外转录碱基药物的窗口。

关键词：自由贸易区；N6-甲基腺苷；柴胡皂苷D；白血病。

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利益冲突声明

竞争利益：作者声明不存在竞争利益。

数字

图1
图1
SsD具有抗增殖活性并促进髓系分化和凋亡。（A） 治疗48小时后，在SsD处理的AML细胞中进行CCK-8分析。（B） 用不同浓度的SsD处理NB4、Kas-1、MV4-11和U937细胞进行集落形成分析。图像显示了具有代表性的平板和（D）克隆。（C） 图中显示了3个独立实验的菌落数，以及（E）10个克隆的克隆大小量化。数据为平均值±SD*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。（F-G）使用基于PI染色的FACS在NB4细胞治疗48小时后测定SsD对细胞周期阻滞和凋亡的影响。
图2
图2
识别与SsD反应相关的基因和通路。（A） 对照组与SsD处理的NB4细胞中7174个基因的典型散点图中，3732个上调基因标记为红色，3442个下调基因标记为蓝色。（B） 对照组与SsD处理的NB4细胞中下调和上调基因的KEGG通路分析（基于RNA-seq结果）。通过FDR校正P值，认为FDR<0.01显著增加。（C） 同样，对照组与SsD处理的NB4细胞中下调和上调基因通路的基因集富集分析（GSEA）。通过FDR校正P值，认为FDR<0.01显著增加。（D） 维恩图显示了SsD抑制信号通路的核心基因和MSigDB数据库中的四条共享信号通路。（E） 在NB4细胞中，SsD抑制的前四种信号通路。（F） 文氏图显示SsD治疗或敲除介导的FTO抑制后信号通路中上调或下调的基因。（G） SsD处理NB4细胞中显著下调或上调基因的热图分析。
图3
图3
FTO是SsD的直接目标。（A） 显示了SsD的分子结构。（B） 分子对接图显示了SsD在FTO中的潜在结合囊。（C） FTO与SsD结合的结构复合体。显示了周围的氨基酸和α-KG。（D） Western blot显示1µM SsD对FTO蛋白热稳定性的影响。在细胞裂解液中测定CETSA。结果来自三个生物重复。（E） SsD与FTO相互作用的核磁共振测量。（F） 通过LC-MS/MS定量测定SsD的细胞摄取。用1µM SsD处理AML细胞48小时（G）体外SsD对m的FTO脱甲基活性的抑制定量6RNA中的A使用HPLC。（H） 在无细胞系统中，m6显示了不同SsD浓度和FTO蛋白存在时的丰度。
图4
图4
SsD诱导m6修改。（A） 米6显示了用SsD处理的指示细胞的斑点印迹。MB（亚甲基蓝）代表RNA样品的装载控制。（B） m的FTO脱甲基的TSQ痕迹6在NB4和Kas-1细胞中分别显示了在没有和存在SsD的情况下ssRNA中的A。（C） 用qPCR测定经SsD处理的细胞中指示基因的表达水平。数据代表三个独立的实验。（D） SsD处理细胞中指示基因蛋白质水平的Western blot分析。用SsD处理NB4和Kas-1细胞24小时，然后用5µg/mL放线菌素D处理指定时间点，进行（E-F）qPCR分析。基因表达标准化为GAPDH。（G-H）Western blot分析用SsD处理24小时的细胞蛋白质稳定性，然后用200 nM嘌呤霉素处理指定的时间点。图中显示了归一化为β-肌动蛋白的Western blot分析的量化；数据代表三个独立的实验，并表示平均值±SD*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图5
图5
SsD显著抑制敏感AML的进展体内.（A） 将C1498和FLT3+细胞静脉注射到4周龄C57BL/6小鼠体内，培育出白血病小鼠。白细胞计数被用作白血病发病的指标。每周注射SsD或载体3次，持续3周。（B） 显示了白血病小鼠（n=8）的白细胞计数。（C） 图像显示了具有代表性的脾脏外部视图，并对H&E染色的脾脏切片（比例尺，1 cm，下部）和Wright-Giemsa染色的骨髓（BM）细胞（上部）进行了组织学分析。（D-E）显示了原始细胞和脾脏重量的量化。（F） 通过Kaplan-Meier生存分析计算白血病小鼠的生存曲线（n=8）。（G） 使用斑点杂交分析，m6在48小时后，在SsD处理的原代BM细胞中测定RNA样品的丰度。结果来自两个生物复制品。（H） qPCR表达分析MYC、CEBPA、ASB2、，和RARA公司BM。数据为平均值±SD*P<0.05，**P<0.01。
图6
图6
SsD抑制患者原代细胞。（A） 对来自两名接受SsD治疗48小时的患者的细胞进行CCK-8分析。显示来自3个独立实验的菌落数的图表。数据为平均值±SD*P<0.05，**P<0.01。（C） 治疗48小时后，使用基于PI染色的患者细胞FACS测定SsD对细胞周期阻滞的影响。（D） SsD处理48小时后，m6用斑点杂交法测定了原代患者细胞中RNA样本的丰度。（E） m的FTO脱甲基的TSQ痕迹6患者细胞中SsD缺失和存在（1µM SsD 48 h）时ssRNA中的A。（F） 患者SsD处理细胞中指示基因的qPCR表达分析。数据代表三个独立的实验。（G） 患者SsD治疗细胞中指示基因的Western blot分析。（H） 将患者细胞静脉注射到4周龄NSG小鼠体内，培育出白血病小鼠。（一） 显示了白血病小鼠（n=3）的白细胞计数。（J） 图像显示了具有代表性的脾脏外部视图，并对来自白血病小鼠的H&E染色脾脏切片（比例尺，1 cm，中间）、Wright-Giemsa染色骨髓（BM）细胞（左侧）和H&E着色切片的肺外部视图（右侧）进行了组织学分析。（K-M）显示了原始细胞（K）、脾脏重量（L）和肺部肿瘤生长结节（M）的定量。（N） 显示了通过Kaplan-Meier生存分析（N＝5）计算的携带白血病的小鼠的生存曲线。
图7
图7
SsD克服N6-甲基腺苷介导的白血病对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性。（A） 经SsD处理24小时的耐药细胞中的CCK-8分析（B）6在SsD处理48小时后，亲本抗性细胞中的RNA样本丰富。（C） m的定量6使用LC-MS/MS对用1µM SsD处理48 h的抗性细胞的mRNA进行A/A分析。（D）显示了用SsD治疗的抗性细胞中指示基因的Western blot分析。（E） 对经SsD处理的抗性细胞中的指示基因进行了qPCR表达分析。数据代表三个独立的实验。（F） 图中显示了用SsD处理24 h，然后用5µg/mL放线菌素D处理指定时间点的Kas-1NR和MV4-11PR细胞的qPCR分析。基因表达水平归一化为GAPDH。（G） 显示了用SsD处理48小时的细胞中抗嘌呤霉素的Western blot分析，随后在指定的时间点用200 nM嘌呤菌素处理。图是归一化为β-肌动蛋白的Western blot结果的定量表示。（H） 通过静脉注射Kas-1或Kas-1NR（0.5×106)将细胞培养成4周大的小鼠（每周三次，持续三周）。（一） 显示肿瘤图像和（J）肿瘤生长定量。（K） 米6介绍了肿瘤的斑点杂交分析。
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