Combined inhibition of Aurora-A and ATR kinase results in regression of MYCN-amplified neuroblastoma

doi:10.1038/s43018-020-00171-8

.2021年3月；2(3):312-326.

doi:10.1038/s43018-020-00171-8。 Epub 2021年2月11日。

Aurora-A和ATR激酶联合抑制导致MYCN公司-放大神经母细胞瘤

附属公司

¹西奥多·波维里研究所，生物化学和分子生物学系，德国瓦茨堡大学生物中心，Am Hubland，97074。
²英国萨里郡萨顿市贝尔蒙特科茨沃尔德路15号皇家马斯登NHS信托机构癌症研究所临床研究和癌症治疗科。
^三德国柏林，林登伯格-韦格80，13125，Max Delbrück Center和CharitéBerlin实验和临床研究中心。
⁴苏黎世大学疾病分子机制系，瑞士苏黎世Winterthurerstraße 190，8057。
⁵哥廷根大学分子生物科学中心分子肿瘤学研究所，德国哥廷根Justus von Liebig Weg 11，37077。
⁶英国萨里郡萨顿市贝尔蒙特科茨沃尔德路15号皇家马斯登NHS信托基金会癌症研究所放射治疗和成像科。
⁷Theodor Boveri研究所，核心单元高含量显微镜，生物中心，维尔茨堡大学，Am Hubland，德国维尔茨堡97074。
⁸分子生物学研究所，Ackermannweg 4，55128 Mainz，德国。
⁹英国利兹LS2 9JT利兹大学生物科学学院。
¹⁰德国维尔茨堡大学医院梅因弗兰肯综合癌症中心，邮编97080，Josef-Schneider Str.6。
¹¹伦敦大学学院大奥尔蒙德街儿童健康研究所，伦敦吉尔福德街30号，WC1N 1EH，英国。
¹²米尔德丽德·谢尔早期职业中心，德国瓦茨堡大学医院，约瑟夫·施奈德街6号，邮编97080。

^#贡献均等。

PMID： 33768209
预防性维修识别码： PMC7610389号
内政部： 10.1038/s43018-020-00171-8

Aurora-A和ATR激酶联合抑制导致MYCN公司-放大神经母细胞瘤

伊莎贝拉·罗切特等人。 Nat癌症. 2021年3月.

.2021年3月；2(3):312-326.

doi:10.1038/s43018-020-00171-8。 Epub 2021年2月11日。

附属公司

¹西奥多·波维里研究所，生物化学和分子生物学系，德国瓦茨堡大学生物中心，Am Hubland，97074。
²英国萨里郡萨顿市贝尔蒙特科茨沃尔德路15号皇家马斯登NHS信托机构癌症研究所临床研究和癌症治疗科。
^三德国柏林，林登伯格-韦格80，13125，Max Delbrück Center和CharitéBerlin实验和临床研究中心。
⁴苏黎世大学疾病分子机制系，瑞士苏黎世Winterthurerstraße 190，8057。
⁵哥廷根大学分子生物科学中心分子肿瘤学研究所，德国哥廷根Justus von Liebig Weg 11，37077。
⁶英国萨里郡萨顿市贝尔蒙特科茨沃尔德路15号皇家马斯登NHS信托基金会癌症研究所放射治疗和成像科。
⁷西奥多·波维里研究所，核心单元高含量显微镜，德国瓦茨堡大学生物中心，Am Hubland，97074。
⁸德国美因茨Ackermannweg 4，55128，分子生物学研究所。
⁹英国利兹LS2 9JT利兹大学生物科学学院。
¹⁰德国维尔茨堡大学医院梅因弗兰肯综合癌症中心，邮编97080，Josef-Schneider Str.6。
¹¹伦敦大学学院大奥尔蒙德街儿童健康研究所，伦敦吉尔福德街30号，WC1N 1EH，英国。
¹²米尔德丽德·谢尔早期职业中心，德国瓦茨堡大学医院，约瑟夫·施奈德街6号，邮编97080。

^#贡献均等。

PMID： 33768209
预防性维修识别码： PMC7610389号
内政部： 10.1038/s43018-020-00171-8

摘要

放大MYCN公司是高危神经母细胞瘤亚群中的驱动癌基因。MYCN蛋白和Aurora-A激酶在S期形成复合物，稳定MYCN。在这里，我们表明MYCN激活染色质上的Aurora-A，该染色质在S期丝氨酸10处磷酸化组蛋白H3，促进组蛋白H3.3的沉积并抑制R环的形成。抑制Aurora-A会引发转录-复制冲突，并激活共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关（ATR）激酶，从而限制Aurora-A抑制时的双链断裂积累。Aurora-A和ATR的联合抑制在神经母细胞瘤小鼠模型中诱导猖獗的肿瘤特异性细胞凋亡和肿瘤消退，导致在一部分小鼠中永久根除。治疗效果是由于肿瘤细胞内在和免疫细胞介导的机制。我们认为，针对Aurora-A解决转录-复制冲突的能力是治疗MYCN公司-驱动性神经母细胞瘤（141字）。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突作者声明没有相互竞争的利益。

数字

**图7。联合治疗涉及免疫系统。**
a.四个肿瘤体积的相对变化*MYCN公司*-在使用指定抑制剂治疗期间放大PDX模型。所示为平均值±S.E.M.。每个实验队列至少有三只动物。使用非配对双侧t检验计算对照组与组合组的P值。b.显示联合Aurora-A/ATR抑制治疗的TH-MYCN小鼠肿瘤中CD45和cGAS阳性细胞的代表性肿瘤切片的组织学。每组至少有四只动物。c.（d）中肿瘤切片中CD45-（左）和cGAS-阳性（右）染色的方框图。使用未配对双侧t检验和Welch校正计算P值（对每种情况下至少4只动物的n≥12个切片进行评估）。d.使用载体或AZD6738（每天25毫克/千克）和MLN8237（每天15毫克/千克，每天5天，每天2天）联合治疗后，NSG或129SvJ小鼠皮下移植瘤体积的相对变化。所示为平均值±S.E.M.。每组由五只动物组成。使用非配对双尾t检验计算第15天NSG和129SvJ联合治疗的相对肿瘤体积的P值。e.总结我们发现的模型。为了表达清晰，只显示了一个核小体。

**扩展数据图1。Aurora-A在S相磷酸化H3S10**
a.通过双胸苷块（T0）在G1/S边界处同步IMR-5细胞的碘丙基染色FACS图谱。异步单元显示为控件。细胞从块中释放4小时进入S期，8小时进入G2/M期，14小时进入G1期。数据代表3个具有类似结果的独立实验。b.同步分馏*MYCN公司*-扩增的IMR-5神经母细胞瘤细胞。（左）：在每个组分等分的免疫印迹上探测指示蛋白质。具有类似结果的3个独立实验的数据代表。（右）：每个细胞周期阶段Aurora-A水平的定量。显示的是平均值±标准差（n=3个独立实验）。c.用10058-F4（100μM）处理4小时的异步IMR-5细胞中指定基因座的MYCN ChIP。IgG对照用作抗体特异性的对照。数据以技术三倍的平均值表示。具有类似结果的3个独立实验的数据代表。d.IMR-5细胞指示蛋白的免疫印迹，可以是异步的，也可以是通过双胸苷块同步进入S或G2期的，或者是通过与诺卡唑孵育16小时同步进入有丝分裂的。具有类似结果的2个独立实验的数据代表。e.记录极光激酶抑制剂特异性的雷达斑点：MLN8237、MK5108、AZD1152；数据来自。f.与对照（DMSO）细胞相比，用MLN8237（1μM）处理8小时的IMR-5细胞中pH3S10染色的定量；每个灰点代表一个单元格。在S期和G2期，点的数量和有丝分裂细胞中pH3S10信号相对于DMSO的强度显示出来。数据表示为平均值±S.D.（n≥614个细胞，每个条件检查3个独立实验）。g.用100 nM MLN8237、1μM MK5108或DMSO作为对照处理8小时的S期IMR-5细胞的pH3S10染色的定量。每个点代表一个单元格。数据以平均值±S.D.表示（在3个独立实验中，每种条件下检查的细胞数≥147个）。h.以100 nM MLN8237、100 nM AZD1152或DMSO作为对照，定量处理8 h的IMR-5细胞中的pH3T3强度；每个灰点代表一个单元格。图中所示为平均值±S.D.（n≥47个细胞，每个条件检查3次独立实验）。i.具有类似结果的3个独立实验的代表性示例图片。白线表示15μm。

**扩展数据图2。Aurora-A抑制对H3.3和pH3S10的影响**
a.（顶部）：象形文字，说明与pH3S10 DMSO（蓝色矩形）相比，pH3S0 MLN8237中减少最强的50个箱子。（底部）：用1μM MLN8237（红线）和DMSO（蓝线）处理4小时的S相同步IMR-5细胞的所有染色体上pH3S10相对于总H3的水平（n=2个独立实验）。b.用1μM MLN8237处理S期同步IMR-5细胞4h后，在指定位点的pH3S10 ChIP。IgG对照用作抗体特异性的对照。数据以技术三倍的平均值表示。代表3个具有类似结果的独立实验的数据。c组蛋白H3.3和pH3S10在用MLN8237（1μM）或DMSO处理4小时的S相同步IMR-5细胞中的ChIP-Rx信号的Metagene图。该图以N=14340基因TSS下游的第一个核小体（“+1二联体”）为中心。（n=2个独立重复）。d.MYCN高（左）和低（右）结合位点的MYCN、总RNAPII、ChIP-Rx的H3.3和pH3S10的浏览器轨迹。无核小体区以灰色表示。e.用1μM MLN8237或DMSO处理4 h的S相同步IMR-5细胞中组蛋白H3和组蛋白H3.3的ChIP-Rx信号的后基因图。对于N=14340个基因（N=3个独立实验），信号集中在位于TSS下游的第一核小体（“+1二元体”）上。f.异步SH-EP和SH-EP-MYCN细胞的免疫印迹。使用文丘林作为负荷控制。具有类似结果的3个独立实验的数据代表。

**扩展数据图3。极光A影响S期RNAPII、剪接和R环形成**
a.用1μM MLN8237、1μM MK5108或溶剂对照（DMSO）处理4 h的S相同步IMR-5细胞中，所有表达基因的后基因图（N=17533）显示了总RNAPII的ChIP-Rx信号在转录区内的分布（N=2个独立实验）。b.2D核密度图，显示用MLN8237（1μM）处理4小时的S期同步细胞和对照（DMSO）细胞中的RNAPII旅行比率（n=2个独立实验）。c.用MLN8237（1μM）、MK5108（1μM）或DMSO处理2 h的S相同步IMR-5细胞中RNAPII pSer2的ChIP-Rx信号的转基因图。对于n=14340个基因（n=2个独立复制），信号集中在位于TSS下游300 nt内的第一个核小体（“+1二联体”）上。d.在FASN基因处，ChIP-Rx的MYCN、总RNAPII和RNAPII pSer2的浏览器轨迹。e.IMR-5细胞的免疫印迹，这些细胞在指定的细胞周期阶段同步，并用普拉二烯内酯B（PlaB；1μM）、MLN8237（1μM。肌动蛋白被用作负荷控制。具有类似结果的3个独立实验的数据代表。f.阅读类别的定义；蓝线显示读取映射到的位置；灰色类别（外显子、剪接）阅读代表成熟mRNA，蓝色阅读类别（外显子-内显子、内含子）代表非剪接前mRNA，红色类别（TSS、TES、TES-RT、基因间）代表无编码序列的RNA。TSS：转录起始位点，TES：转录终止位点。g.显示S相同步IMR-5细胞中4sU测序实验设置的图表。h.（f）中描述的每个类别中恢复的读取的平均百分比（n=3个独立实验）。所有处理（PlaB、MK、MLN）均显著降低了与“DMSO”对照组相比的拼接读取百分比（使用配对双尾t检验和Wilcoxon配对双签名秩检验，p<1.0e-15）。i.1μM MLN8237或1μM PlaB治疗8小时后，使用S9.6抗体进行DRIP。以RNaseH1和IgG孵育作为对照。所示为技术三倍的平均值。具有类似结果的两个独立实验的数据代表。j.（左）在siAurora-A治疗48小时后，使用S9.6抗体进行DRIP。所示为技术三倍的平均值。（右）siRNA-转染IMR-5细胞的免疫印迹。使用文丘林作为负荷控制。具有类似结果的两个独立实验的数据代表。

**扩展数据图4。DNA复制和R环形成的表征**
a.用100 nM或1μM MLN8237、1μM AZD6738或组合（100 nM MLN82 37和1μM a ZD6728）预处理3 h的SH-EP和SH-EP MYCN细胞的分叉进展量化。通过比较两种条件下的非配对双尾t检验计算P值（每种条件下n≥168根纤维通过两个独立实验进行检查）。b.具有可诱导Aurora-A WT和T217D的IMR-5或IMR-5细胞的Annexin-V/PI FACS。在用强力霉素预处理24小时以诱导Aurora-A WT和T217D后，用MLN8237（100 nM）、AZD6738（1μM）或两者处理细胞48小时。所示为平均值±S.D.（n=3个独立实验）。c.IMR-5的Annexin-V/PI FACS用MLN8237（100 nM）、CHIR-124（1μM）或两者处理48小时。所示为平均值±S.D.（n=3个独立实验）。d.使用表达多西环素诱导的HA-RNaseH1的IMR-5细胞的S9.6抗体的DNA RNA免疫沉淀（DRIP）。在强力霉素处理24小时后，用1μM MLN8237处理细胞8小时。用RNaseH1和IgG培养作为非特异性染色质结合的对照。所示为技术三倍的平均值。具有类似结果的两个独立实验的数据代表。插入物显示了强力霉素治疗24小时后异步IMR-5细胞中HA-RNaseH1的表达。使用Vinculin（VCL）作为负荷控制。具有类似结果的3个独立实验的数据代表。e.用强力霉素处理24小时以诱导RNaseH1表达或EtOH（作为对照）的S相同步RNaseH1-IMR-5细胞中总RNAPII和H3.3的ChIP-Rx信号的后基因图。数据显示N=3731基因的平均值。信号以位于TSS下游300 nt范围内的第一个核小体（“+1二元体”）为中心（n=2个独立实验）。f.（e）中MYCN的浏览器轨迹和ChIP-Rx的总RNAPIIFASN公司和*NCL公司*基因。g.用强力霉素（诱导RNaseH1表达）或EtOH（作为对照）处理24小时的S相同步RNaseH1-IMR-5细胞中RNAPII pSer2的ChIP-Rx信号的转基因图。数据显示n=14340个基因。信号以位于14340个基因TSS下游300 nt内的第一个核小体（“+1二联体”）为中心（n=2个独立实验）。h.在用强力霉素处理24小时以诱导RNaseH1表达的异步RNaseH1-IMR-5细胞中，定量RNAPII和PCNA之间的PLA信号。每个点表示与溶剂对照相比，一个孔中所有细胞的平均PLA信号。图中所示为平均值±S.D.。P值是使用相对于DMSO对照的非配对双尾t检验计算的（n=3个独立实验）。i.箱线图，显示用指示药物治疗（8 h）后有丝分裂细胞中pKAP1染色的强度，并诱导RNaseH1表达24 h。使用每种条件下EtOH和Dox之间的双尾t检验计算P值（每种条件n≥50个细胞通过2个独立实验进行检查）。

**扩展数据图5。治疗无毒且肿瘤特异**
a.方框图，显示治疗24小时或5天的小鼠肿瘤组织中指示抑制剂的浓度。N=4只小鼠（对照组，24小时治疗），5只小鼠（5天治疗）。b.与溶媒对照组相比，经MLN8237和AZD6738治疗的小鼠体重的相对变化。所示为平均值±S.D.N=42只小鼠（对照组），43只小鼠（治疗组）。c.用不同RNase培养的S9.6对肿瘤组织进行染色，以证明S9.6的特异性。R环染色（每个实验条件下n=1个切片）。d.显示H&E、Ki-67和裂解caspase 3染色的未治疗（顶部）和治疗（底部）小鼠的肠组织增生组织的组织学。N=2只小鼠（对照组），3只小鼠接受治疗）。e.具有代表性的MRI以及用MLN8237和olaparib联合治疗的肿瘤切片（N=3只动物接受了评估）。f.两只长期存活小鼠在第0天和联合使用AZD6738（30 mg/kg）和MLN8237（15 mg/kg）治疗7天后的MRI切片。白色虚线表示肿瘤周长。g.使用Mantel-Cox log-rank检验计算的P值，比较图6c所示的不同组的存活率。

**扩展数据图6。患者衍生异种移植模型的疗效**
a.典型肿瘤切片的组织学*MYCN公司*-放大PDX模型按指示处理。AZD6738每天给药50 mg/kg，MLN8237每天给药7.5 mg/kg，每天给药5天，不给药2天。显示治疗14天后恢复的肿瘤染色。每组由三只动物组成。b.方框图显示肿瘤切片中R-loop-、γH2AX-和裂解caspase 3阳性细胞的定量。使用未配对双尾t检验和Welch校正计算P值（评估了第（a）组所述动物的n≥9个截面）。c.四个肿瘤体积的相对变化*MYCN公司*使用指定抑制剂治疗后的非扩增PDX模型。所示为平均值±S.E.M.N表示每个实验队列的动物数量。比较对照组和组合组（用黑色虚线表示）的P值采用非配对双侧t检验计算。

**扩展数据图7。Aurora-A/ATR抑制激活免疫系统**
a.GSEA签名显示TH-MYCN（顶部）和PDX（底部）模型中指示干扰素γ反应的特征基因集的反应。b.（上图）：流式细胞仪显示细胞门控的代表性图片。（底部）：CD45人群⁺AZD6738（25 mg/kg）和MLN8237联合治疗TH-MYCN小鼠后肿瘤微环境中的免疫细胞。所示为平均值±S.E.M.。显著性通过非配对双尾t检验计算（每种情况下评估了4只动物）。c.经Aurora-A/ATR联合抑制治疗的TH-MYCN小鼠肿瘤中显示NKp46阳性细胞和pSTAT1的代表性肿瘤切片的组织学。N=4只小鼠（对照组，24小时治疗），5只小鼠（5天治疗）。d.用载体或MLN8237和AZD6738（25 mg/kg）联合治疗后裸鼠皮下异种移植瘤体积的相对变化。所示为平均值±S.E.M.（N=每组5只动物）。e.显示用MLN8237和AZD6738处理的同种异体移植物小鼠的存活率的条形图。所示为平均值±S.E.M.（N=每组4只动物）。

**图1。Aurora-A控制组蛋白H3在S期的磷酸化。**
a.（顶部）：用100μM 10058-F4或DMSO处理4小时的S相同步IMR-5细胞的指示蛋白质的免疫印迹。（底部）：染色质结合蛋白相对水平的定量。所示为平均值±标准偏差（S.D.）。P值是使用与二甲基亚砜相关的配对双尾t检验计算得出的（n=3；除非另有规定，n表示独立生物复制的数量）。b.pH3S10、EdU、Cyclin B1和Hoechst染色的免疫荧光染色（顶部）：显示每个细胞周期阶段pH3S0染色的图片。比例尺为5μm。（底部）：与对照（DMSO）细胞相比，用MLN8237（100 nM）处理8小时的IMR-5细胞中pH3S10染色的定量；每个灰点代表一个单元格。与二甲基亚砜相比，在S期和G2期的斑点数量和有丝分裂细胞中pH3S10信号的强度都显示出来。所示为平均值±S.D.（在3个独立实验中检查的n≥137个细胞）。c.用100 nM MLN8237（数据与图1b相同）或100 nM AZD1152相对于对照（DMSO）细胞处理8 h的IMR-5细胞中pH3S10染色的定量；每个灰点代表一个单元格。与二甲基亚砜相比，在S期和G2期的斑点数和有丝分裂细胞中pH3S10信号的强度都显示出来。所示为平均值±S.D.（n≥390个细胞在3个独立实验中被检测）。d.用1μM MLN8237或DMSO处理4 h的S相同步IMR-5细胞中组蛋白H3.3和pH3S10的ChIP-Rx信号的后基因图。信号以位于TSS下游的第一个核小体（“+1二元体”）为中心。3000个MYCN启动子占用率最高的表达基因的阴影为±S.E.M。（n=3）。e.MYCN启动子占用率最低的3000个表达基因的后基因图，如（d）所示。f.在SH-EP和SH-EP MYCN细胞中与MLN8237（1μM）孵育4小时后，pH3S10（左）和组蛋白H3.3（右）ChIP位于指示位点，同步于S期。所示为代表性实验（n=2）中技术三等分的平均值±S.D。

**图2。Aurora-A抑制导致转录-复制冲突。**
a.用MLN8237（1μM）、MK5108（1μM）或DMSO处理4 h的S相同步IMR-5细胞中RNAPII pSer2的ChIP-Rx信号的转基因图。信号以位于TSS下游300 nt内的第一个核小体（“+1二元体”）为中心。数据显示，平均+/-S.E.M.为3000个表达基因的阴影，MYCN启动子占用率最高（n=2）。b.如（a）所示，筛选出MYCN启动子占用率最低的3000个表达基因的转基因图谱。c.用MLN8237（1μM）或DMSO处理2 h的S相同步IMR-5细胞的第一个外显子-外显子边界（+/-200 nt）周围RNAPII pSer2 ChIP-Rx平均占有率的Bin图。所示为每个箱子中3000个基因的平均值±S.E.M。基因按MYCN占有率排序（n=2）。d.使用S9.6抗体进行DNA-RNA-免疫沉淀（DRIP），在MLN8237（1μM，8 h）治疗后检测指定位点的R环。使用RNaseH1和IgG孵育作为非特异性染色质结合的对照。所示为代表性实验（n=3）技术三倍的平均值±S.D。e.使用S9.6抗体进行DNA-RNA-免疫沉淀（DRIP），在1μM MLN8237或1μM AZD1152处理8小时后，在指定的位点指示R环。用RNaseH1和IgG培养作为非特异性染色质结合的对照。所示为代表性实验（n=2）技术三倍的平均值±S.D。f.用所示抑制剂（MLN8237、MK5108（1μM）、NVP-2（200 nM）或Flavopiridol（FP；200 nM。对照组显示仅在用1μM MLN8237处理的细胞中存在初级抗体。（上图）：PLA在不同条件下的照片示例。（下）：PLA信号的量化。每个点表示与溶剂对照相比，一个孔中所有细胞的平均PLA信号。图中所示为平均值±S.D.。使用非配对双尾t检验计算治疗与二甲基亚砜的比较P值。白线表示5μm（n≥6）。

**图3。Aurora-A/ATR抑制可减少复制叉进展。**
a.用指示浓度的Aurora-a抑制剂处理8小时后，IMR-5细胞中的pRPA S33染色。所示为每个条件下的平均强度±S.D。；每个点代表一个细胞（在3个独立实验中检测的n≥73个细胞）。颜色表示平均值与对照组的显著差异（蓝色：p=0.0004；红色：p<0.0001，DMSO与MLN 5μM p<1.0e-15，DMSO-与MLN 10μM p=1.9e-13）。b.以MLN8237（MLN）和AZD6738（AZD，1μM）或DMSO为对照，处理4小时（S期）或8小时（G2/M期）的细胞周期同步IMR-5细胞的免疫印迹。以紫外线作为阳性对照。使用文丘林作为负荷控制。箭头表示特定带，而（*）表示非特定带（n=3）。c.用100 nM MLN8237、1μM AZD6738或两者的组合处理3 h的IMR-5细胞的分叉进展速度。实验装置如顶部所示。将细胞用CldU孵育20分钟，然后用IdU孵育1小时。使用吉西他滨（300nM）作为阳性对照。通过比较两种条件下的非配对双尾t检验计算P值（n≥142根纤维通过两个独立实验进行检查）。d.（c）中处理和量化的纤维的代表性示例图片。e.用10μM Olaparib处理8 h的异步IMR-5细胞中RNAPII和PCNA之间PLA信号的量化。每个点表示与溶剂对照相比，一个孔中所有细胞的平均PLA信号。所示为平均值±S.D.。使用非配对双尾t检验（n=4）计算P值与DMSO的比较。f.通过使用100 nM MLN8237、10μM Olaparib或其组合预处理3 h的IMR-5细胞的纤维分析来量化分叉进展。使用非配对双尾t检验计算P值（在两个独立实验中检查了n≥128根纤维）。g.（c）中处理和量化的纤维的代表性示例图片。

**图4。Aurora-A/ATR抑制导致DNA损伤。**
a.基于显微镜的高含量分析*MYCN公司*-用100 nM MLN8237、1μM AZD6738或其组合处理扩增的NGP细胞8小时，并评估EdU掺入、γH2AX、pKAP1和pH3S10。每个点代表一个单个细胞，并根据平均荧光强度进行彩色编码（n≥3837个细胞通过3个独立实验进行检测）。A.U.任意单位。量化如（b）所示。b.（a）中显示的γH2AX（上面板）和pKAP1（下面板）信号的量化（n≥3837个细胞通过3个独立实验进行检查）。c.所示细胞系的Annexin-V/PI FACS（MYCN）非放大：SH-EP、SK-NAS、SH-SY5Y；*MYCN公司*-扩增：IMR-5、NGP、IMR-32）用DMSO、MLN8237（100 nM）、AZD6738（1μM）或两者处理48小时。所示为平均值±S.D.，p值采用配对双尾t检验计算（n=3）。d.在S期同步化IMR-5细胞中100 nM或1μM MLN8237处理4小时后，DCP1A（左）和EDC4（右）ChIP位于指定位点。IgG对照用作抗体特异性的对照。数据表示为代表性实验（n=3）技术三倍的平均值±S.D。

**图5。Aurora-A/ATR联合抑制的治疗反应。**
a.未经治疗、24小时治疗或5天治疗的TH-MYCN小鼠肿瘤的代表性切片，显示苏木精和伊红（h&E）、Ki67、R-loops、γH2AX、53BP1、pKAP1和裂解半胱天冬酶3。裂解半胱天冬酶染色的第二列显示了同时治疗的荷瘤小鼠的肾组织。每组至少有四只动物。b.方框图显示肿瘤切片中R-环-、γH2AX-、53BP1-、pKAP1-和裂解的胱天蛋白酶3-阳性细胞的定量。使用Welch校正的非配对双尾t检验计算P值（评估每种情况下至少4只动物的n≥12个切片）。c.未经治疗、24小时或5天治疗的TH-MYCN小鼠肿瘤的代表性切片显示H3S10磷酸化。箭头标记有丝分裂细胞。第二行显示邻近肾组织的染色。每组至少有四只动物。d.面板b中显示的pH3S10-阳性非有丝分裂细胞（左）和有丝分裂电池（右）的相对数量。使用Welch校正的非配对双尾t检验计算P值（针对每种情况评估至少4只动物的n≥12个切片）。

**图6。Aurora-A/ATR抑制剂联合治疗的疗效。**
a.用溶媒、MLN8237（15 mg/kg）、AZD6738（25 mg/kg）或两者治疗后第0天和第7天的小鼠代表性MRI切片。白色虚线表示肿瘤周长。b.瀑布图，显示在开始使用指定药物治疗的前七天内肿瘤体积的相对变化。标有哈希（#）的对照动物在第4天显示测量结果。治疗后存活150天的小鼠标有星号（*）。c.按指示治疗的TH-MYCN小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。AZD6738每天给药25-30 mg/kg，MLN8237每天给药15 mg/kg，每天给药5天，不给药2天。阴影区表示联合治疗的持续时间（结束于32天，56次剂量）（MLN8237+AZD6738（30 mg/kg）的n=8只动物，所有其他实验队列的n=4只）。P值如扩展数据图5g所示。

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