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.2021年2月4日；17（2）：e1009283。
doi:10.1371/journal.pgen.1009283。 eCollection 2021年2月。

ATF3下调其新靶点IFI6和IFI27，以抑制舌鳞癌细胞的生长和迁移

林旭 1 2 3 4, 庭坚组 1 5, 陶莉 1 2, 李敏 4, Mi君 1, 白福祥 1, 刘冠毅 1, 杰文 1, 李慧（音） 6, 绳索制动总线 7, 王旭霞 2, 吴寻伟 1
附属公司

ATF3下调其新靶点IFI6和IFI27，以抑制舌鳞癌细胞的生长和迁移

林旭等。 公共科学图书馆-基因. .

摘要

激活转录因子3（ATF3）是调节细胞应激反应的关键转录因子，在不同组织中具有不同的表达水平和功能。ATF3也被证明在调节肿瘤的发展和进展中起着关键作用，但其在口腔鳞状细胞癌中的潜在作用尚未得到充分研究。在本研究中，我们检查了舌鳞状细胞癌（TSCC）的活检，发现ATF3的核表达水平与TSCC的分化状态呈负相关，这通过对ATGC数据库的分析得到了验证。通过对四种不同TSCC细胞系中ATF3的功能获得或丧失分析，我们证明ATF3在体外对人TSCC细胞的生长和迁移具有负调控作用。RNA-seq分析确定了ATF3的两个新下游靶点，即干扰素α诱导蛋白6（IFI6）和27（IFI27），它们在ATF3缺失细胞中上调，在ATF3-过度表达细胞中下调。染色质免疫沉淀分析表明，ATF3结合IFI6和IFI27基因的启动子区域。IFI6和IFI27在TSCC活检中均高表达，TSCC细胞中IFI6或IFI27的敲除阻断了ATF3缺失诱导的细胞生长和迁移。相反，IFI6或IFI27的过度表达抵消了ATF3过度表达诱导的TSCC细胞生长和迁移的抑制。最后，一项小鼠体内研究证实了这些体外发现。我们的研究表明，ATF3通过对其下游靶点IFI6和IFI27的负调控，在TSCC中发挥抗肿瘤作用。

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提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。ATF3与TSCC的进展呈负相关。
答：。高、中、低分化临床TSCC肿瘤和正常口腔组织的典型组织学分析图像（H&E染色）。B。来自不同级别TSCC组织的一名患者的ATF3免疫化学染色代表性图像A、，红色箭头表示ATF3的核染色，绿点线表示正常口腔或肿瘤组织中表皮（E）和间充质（M）分区之间的边界。S1图显示了来自不同级别TSCC的另外两名患者的低倍图像和ATF3染色的代表性图像。培养的原代口腔人角质形成细胞（OHKCs）、CAL 27和SCC-9细胞中ATF3（红色）和DAPI（蓝色）免疫荧光染色的代表性融合图像，DAPI用于细胞核染色。红色箭头表示ATF3的核染色。图S3显示了ATF3和DAPI染色的单独图像。A-C：比例尺=100μm。D。用核ATF3染色定量正常口腔上皮细胞和肿瘤细胞的百分比（B)通过计数ATF3核染色细胞在总共200个上皮或肿瘤细胞中的数量来计算B.电气.ATF3核阳性染色百分比的量化C类.F、。从细胞中制备的细胞核和细胞质部分C类用于ATF3的western blot分析。层蛋白B1被用作核组分的负荷控制，GAPDH被用作细胞质组分的负载控制。G.公司。根据ATGC数据得出的正常组织和口腔肿瘤组织中ATF3（相对对数表达）的正常表达水平。D、 E、F：*p<0.05**p<0.01***如图所示，比较两组时，p<0.005。
图2
图2。ATF3的缺失促进TSCC细胞的生长和迁移。
答：。使用CCK8试剂盒在不同时间点分析CRISPR/Cas9介导的ATF3缺失（SG1或SG2）或空载体作为对照（V）的CAL 27细胞的生长**与对照组比较p<0.01。B、 C类用ATF3缺失（SG1或SG2）或对照（V）TSCC细胞进行横向迁移分析；24小时迁移细胞的图像如所示B，不同组中迁移的单元数如所示C类与对照组相比**p<0.01，**p<0.005。比例尺英寸B=100微米。D、 E.公司。在指定时间用ATF3缺失（SG1或SG2）或对照（V）TSCC细胞进行伤口愈合分析，典型的伤口愈合图像如所示D类，伤口闭合百分比计算为E类与对照组相比，**p<0.01。比例尺英寸D类=200微米。F类对对照组和ATF3缺失的TSCC中指示的蛋白质水平进行Western blot分析。红色箭头表示与对照细胞相比，ATF3缺失细胞的带密度增加（V）。G公司.磷酸化AKT（p-AKT）和ERK（p-ERK）水平的量化与相应蛋白质的总水平标准化。*与对照组相比，p＜0.05、**p＜0.01。
图3
图3。ATF3的过度表达抑制TSCC细胞的生长和迁移。
答：。使用CCK8试剂盒在不同时间点分析感染过表达ATF3（ATF3）或表达新霉素作为对照（NEO）的逆转录病毒的SCC-9 TSCC细胞的生长情况***与对照组相比p<0.005。B、 C类用过表达ATF3（ATF3）或对照（NEO）的TSCC细胞进行跨孔迁移测定；24小时迁移细胞的图像如所示B，不同组中通过过滤器迁移的单元格数量如所示C类.**p与对照组相比<0.01。比例尺英寸B=200微米。D、 E类伤口愈合测定是用在指定时间过表达ATF3（ATF3）或对照（NEO）的TSCC细胞进行的；代表性图像如所示D类，伤口闭合百分比计算为E类.*与对照组相比，p<0.05。比例尺=200μm。F类Western blot分析对照NEO和ATF3过度表达（ATF3）TSCC中的指示蛋白质水平。红色箭头表示与对照组相比，带密度降低。G公司量化磷酸化形式AKT（p-AKT）和ERK（p-ERK）的相对水平（密度），并与相应蛋白质的总水平进行标准化*如图所示，与对照组ATF3过度表达细胞相比，p<0.05。
图4
图4。ATF3抑制在TSCC中高度表达的IFI6和IGI27。
答：。ATF3缺失（SG1）和对照（V）CAL 27 TSCC细胞基因表达谱的RNA-seq分析。丰富GO项的点图。基因比率最大的15个GO过程按基因比率顺序显示。点大小表示与GO项相关的对照细胞（V）相比，SG1细胞中表达增加的基因数量。点颜色表示对数p值。B。通过基因聚类分析，在SG1与对照V细胞中上调最多的基因中鉴定出IFI6和IFI27。C、。ATF3缺失（SG1和SG2）和对照（V）TSCC细胞中IFI6和IFI27表达的RT-PCR分析。D。对ATF3过度表达（ATF3）和对照（NEO）TSCC细胞中IFI6和IFI27的表达进行RT-PCR分析。E、 F类：对具有ATF3缺失（SG1或SG2）或ATF3过表达的CAL 27细胞的提取物进行处理，用抗ATF3抗体进行染色质免疫沉淀（CHIP）分析，然后对IFI6进行RT-PCR分析（E）)或IFI27(F类)包含ATF3结合位点的启动子区域（上图中的黑框）。TSS：转录起始点。CHIP产物也用常规PCR进行了分析，PCR产物的凝胶电泳图像如S9图所示。G.公司。6例临床TSCC肿瘤和6例正常组织中IFI6表达的IHC分析。H（H）G中IFI6染色的定量（n=6）.I.一。ATGC数据库中TSCC组织和正常组织中IFI6的表达。J。ATGC数据库中TSCC组织和正常组织中IFI27的表达。两者都有我和J型以Y轴的相对对数表达式显示。C、 D、H-J：与相应对照组相比，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.005。
图5
图5。ATF3通过调节IFI6和IFI27调节TSCC细胞的生长和迁移。
答：。使用CCK8试剂盒在不同时间点分析了CAL 27 TSCC细胞的生长情况，包括CRISPR/Cas9介导的ATF3（SG1）缺失、IFI6（SG1+siIFI6）或IFI27（SG1+4iIFI27）的敲除或干扰siRNA（SG1+siCtrl）的干扰，以及一个空载体和干扰siRNA作为对照（V+siCtrl）。BRT-PCR分析转染后48小时，TSCC细胞预先感染CRISPR/Cas 9 ATF3病毒，然后转染IFI6或IFI27的siRNA。C、。使用CCK8试剂盒在不同时间点分析感染过表达ATF3（ATF3）的逆转录病毒、稳定表达IFI6（ATF3+IFI6）或IFI27（ATF3+IFI27）或GFP（ATF8+GFP）以及表达新霉素和GFP作为对照的SCC-9细胞的生长情况。D类在感染表达ATF3的病毒和表达逆转录病毒的IFI6或IFI27后48小时，对TSCC细胞中的IFI7或IFI6进行RT-PCR分析C类.E、，用CAL 27细胞在同一组中进行伤口愈合迁移分析A、，S11A图显示了受伤后24小时的愈合百分比和伤口愈合图像。F、。在与C、，伤后24小时的愈合率如图所示，伤口愈合图像如S11B图所示。G.公司。使用与C、。图中显示了不同组中迁移细胞的数量，24小时迁移细胞的图像如S11C图所示。H（H）Western blot分析同一组细胞中指示的蛋白质水平A类.我.磷酸化AKT（p-AKT）和ERK（p-ERK）水平的量化与相应蛋白质的总水平标准化H（H）.J型Western blot分析同一组细胞中指示的蛋白质水平C类.英国。磷酸化AKT（p-AKT）和ERK（p-ERK）水平的量化与J型. *答-答：*与所示的相应对照组相比，p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，***p<0.001。
图6
图6。ATF3负调控OSCC细胞生长体内通过调节IFI6和IFI27的表达。
答：。从CAL 27细胞移植物上采集的肿瘤图像，ATF3缺失（SG1或SG2）或对照组（V）。代表我小鼠图像如S12A图所示.B类。肿瘤的重量（A）各组均进行测量；每个闭合的圆圈代表一个肿瘤。C类肿瘤的Ki-67和角蛋白（K14）染色的代表性图像A类。红色箭头表示Ki-67阳性细胞。Ki-67和K14染色图像的低倍放大如S12B和S12C图所示。D。Ki-67阳性细胞的定量和K14染色的相对分数C.E.公司。肿瘤图像取自ATF3（ATF3）过度表达加上IFI6（ATF3+IFI6）或IFI27（ATF3+IFI27）过度表达的SCC-9细胞移植物，NEO作为对照组。代表我小鼠图像如S13A图所示.F.（法语）。肿瘤的重量(E类)各组均进行了测量，并显示在图表中；每个闭合的圆代表一个肿瘤。G、 I、K、MKi-67的代表性图片(G公司)，角蛋白14（K14，我)，角蛋白4（K4，K（K）)和角蛋白13（K13，M（M）)肿瘤染色E类。红色箭头表示Ki-67阳性细胞G公司，K4阳性细胞K（K）和K13阳性细胞M（M）Ki-67、K14、K4和K13染色图像的低倍放大显示为S13B–S13E图。H、 J、L、N.相应的量化G、 I、K和M（M）如标记的。所有量化数据均来自每组6个肿瘤（n=6）：与所示的两个相应对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005。所有比例尺=100μm。
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