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.2021;12(1):141-157.
doi:10.1016/j.jcmgh.2021.01.016。 Epub 2021年1月29日。

CD73以性别依赖的方式维持肝细胞代谢完整性和小鼠肝脏平衡

Karel P Alcedo公司 1, 摩根·A·罗斯 1, 格洛丽亚·荣格 1, 董福 1, 小马奎特 1, 海伦·H·威尔科克森 1, 凯文·格林 2, 娜塔莎·T·施奈德 三
附属机构

CD73以性别依赖的方式维持肝细胞代谢完整性和小鼠肝脏平衡

Karel P Alcedo公司等。 细胞分子胃肠肝素. 2021.

摘要

背景和目标：代谢失衡和炎症是慢性肝病的常见特征。控制这些机制的分子因素是潜在的治疗靶点。CD73是使细胞外单磷酸腺苷（AMP）去磷酸化形成抗炎腺苷的主要酶。CD73在中央周围肝细胞上表达，这对长期肝内稳态很重要。我们旨在确定CD73是否具有非冗余的肝保护功能。

方法：通过靶向肝细胞中的Nt5e基因生成肝特异性CD73敲除（CD73-LKO）小鼠。使用多种方法对CD73-LKO小鼠和肝细胞进行表征。

结果：肝细胞Nt5e的缺失导致肝CD73总蛋白减少约70%（P<0.001）。雄性和雌性CD73-LKO小鼠在前21周发育正常，没有明显的肝脏表型。在21至42周之间，CD73-LKO小鼠发生自发性肝病，雄性小鼠严重程度显著。中年雄性CD73-LKO小鼠出现肝细胞肿胀和膨胀（P<0.05）、炎症（P<0.01）和可变脂肪变性。雌性CD73-LKO小鼠的血清白蛋白水平较低（P<0.05），炎症基因增加（P<0.01），但雄性小鼠的组织病理学变化谱没有显示出来，这可能是由于腺苷受体的代偿性诱导所致。雄性CD73-LKO小鼠肝细胞的血清分析和蛋白质组分析显示出明显的代谢失衡，血尿素氮增加（P<0.0001），主要代谢途径受损，包括氧化磷酸化和AMP-活化蛋白激酶（AMPK）信号。在CD73-LKO肝脏中AMPK底物有显著的低磷酸化作用（P<.0001），而在用AMP处理的分离肝细胞中，可溶性CD73诱导AMPK活化（P<.001）。

结论：肝细胞CD73通过AMPK以性别依赖的方式支持长期代谢性肝内稳态。这些发现对以CD73失调为标志的人类肝脏疾病有意义。

关键词：AMP-活化蛋白激酶；腺苷；Ecto-5'-核苷酸酶；肝分区。；炎症。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
CD73主要在正常小鼠肝脏的肝细胞上表达。t分布随机相邻嵌入（tSNE）和小提琴图显示了来自(A类和B类)荧光激活细胞分选机（FACS）-分选和(C和D类)微流控液滴捕获的细胞显示小鼠CD73编码基因的最高表达Nt5e号在肝细胞中。数据来源于鼠形表(电子)新鲜冷冻肝脏切片用CD73抗体（绿色）和细胞特异性标记物角蛋白K8/18（肝细胞）、K19（胆管细胞）、CD31（内皮细胞）和F4/80（库普弗细胞）染色为红色。最下面一行：放大视图装箱区域在中顶行蓝色，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色细胞核（DNA）。(F类)冷冻肝切片CD73（绿色）免疫荧光染色显示与胆管标志物闭塞带1（ZO1）（红色）共定位。赖特：4倍放大视图装箱区在中合并的面板.DAPI染色的细胞核。蓝色，DAPI染色的细胞核（DNA）。比例尺：20微米。NK，自然杀手；LSEC，肝窦内皮细胞。
图2
图2
肝脏特异性CD73-LKO小鼠的产生。(A类)PCR分析Nt5e号从CD73-LKO小鼠肝脏中的Cre靶向等位基因生成349-bp片段。Nt5e号（重量/重量）,Nt5e号（液体/重量）、和Nt5e号（飞行/飞行）小鼠作为对照。CD73的代表性免疫印迹(B类)原代肝细胞，以及(C)雄性和雌性WT和CD73-LKO小鼠的总肝裂解物。肌动蛋白和组织非特异性碱性磷酸酶（TNAP）免疫印迹作为对照。(D类)基于免疫印迹条带强度的CD73蛋白表达半定量分析C. ∗∗P（P）<.01，***P（P）<0.001，双向方差分析。误差条代表SD(电子)WT冷冻肝组织切片上CD73（绿色）、紧密连接蛋白闭塞带1（ZO1）（红色）和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色DNA（蓝色）的免疫荧光染色(顶部)和CD73-LKO(底部)老鼠。比例尺：20微米。(F类)使用福尔马林固定肝组织切片的WT和CD73-LKO小鼠的AMP酶活性。棕色沉积物表明AMP存在时的外AMP酶活性。星星指示中央静脉。比例尺：400微米。
图3
图3
CD73-LKO小鼠发育正常，至21周龄时未出现重大肝脏异常。(A类)用H&E染色的7周龄雄性小鼠福尔马林固定肝切片。比例尺：200微米。(B类)6–21周龄WT和CD73-LKO小鼠体重的比较。n=15-21只小鼠/组。(C)21周龄小鼠肝体重比分析。雄性：n=18 WT，n=21 CD73-LKO。雌性：n=9 WT，n=15 CD73-LKO。误差条代表SD。
图4
图4
CD73-LKO小鼠在21周龄后以性别依赖的方式发生自发性肝损伤。(A类)21至22周龄雄性（蓝色）和雌性（红色）野生动物丙氨酸氨基转移酶（ALT）的血清分析(实心圆圈)和CD73-LKO小鼠(开放的圆圈). 雄性：n=8 WT；n=8 CD73-LKO；P（P）=0.08（未配对t吨测试）；雌性：n=7 WT；n=7 CD73-LKO。P（P）=.3（未配对t吨测试）。(B类)22周龄雄性和雌性WT和CD73-LKO小鼠福尔马林固定肝切片的代表性H&E图像。比例尺：200微米。(C)36至42周龄雄性WT和CD73-LKO小鼠福尔马林固定肝切片的典型H&E图像。比例尺：200μm。(D类)量化21至42周龄小鼠肝细胞变性（定义为肿胀和膨胀）的盲法组织学评分。得分：0分，无；4、轻度肿胀/局部肿胀；8，严重肿胀/广泛肿胀（肿胀+肿胀动物的平均分数）。*P（P）< .05; 单因素方差分析。方框和胡须图(电子)白蛋白和(F类)男性（蓝色）和女性（红色）WT的血尿素氮（BUN）(实心圆圈)和CD73-LKO小鼠(开放的圆圈). 与面板中的动物相同D类雄性：n=13 WT；n=12 CD73-LKO；雌性：n=14 WT；n=18只CD73-LKO小鼠。*P（P）< .05, ∗∗∗∗P（P）< .0001; 未成对的t吨测试。
图5
图5
雄性CD73-LKO小鼠肝细胞和肝脏的代谢失衡和脂肪变性增加。(A类)蛋白质组结果显示激活的灵巧途径分析(橙色)并被抑制(蓝色)与WT对照组相比，雄性CD73-LKO小鼠新鲜分离肝细胞中的通路。(B类)福尔马林固定肝切片的H&E染色。放大视图装箱区域在中左侧面板比较雄性和雌性CD73-LKO小鼠的脂肪变性。比例尺：200微米。(C)微泡和大泡脂肪变性盲法组织学评分的量化。评分：0，无；1、轻度；2、中度；3，严重（对有微小和巨大骨质疏松的动物进行平均评分）。雄性：n=13 WT；n=12 CD73-LKO；雌性：n=14 WT；n=18 CD73-LKOP（P）<0.001，单因素方差分析。(D类)脂质代谢基因的基因表达分析阿卡卡,嗯,嗯1,Srebp1a公司、和Srebp1c公司在雄性和雌性WT和CD73-LKO小鼠中使用总肝信使RNA。n=13个WT男性，n=12个LKO男性，n=14个WT女性，n=18个LKO-女性。*P（P）< .05, ∗∗∗P（P）< .001, ∗∗∗∗P（P）<0.0001，双向方差分析。误差条代表SD.EIF2，真核生物起始因子2；NER，核苷酸切除修复；PPARα/RXRα、过氧化物酶体增殖物激活受体α/维甲酸X受体α；tRNA，转移RNA。
图6
图6
抑制CD73酶活性可促进肝细胞中的脂质积聚。(A类)在存在或不存在CD73抑制剂APCP（10μmol/L）的情况下，用1μmol/L油酸处理分离的WT C57BL/6雄性肝细胞24小时。使用LipidTOX中性脂质染色分析细胞内脂质积聚(红色). (B类)面板中脂质堆积的量化A类. ∗∗P（P）< .01, ∗∗∗∗P（P）<0.0001；单因素方差分析。误差条代表SD(C)给WT小鼠喂食正常的食物（对照组）或HFD 14周。顶部面板：对照组和HFD喂养小鼠的典型H&E图像，显示HFD条件下脂肪变性的发展。底部面板：典型的酶组织化学图像显示HFD患者CD73 AMP酶活性降低。比例尺：200微米。
图7
图7
CD73产生的细胞外腺苷激活来自CD73-LKO小鼠的肝细胞和肝脏中的AMPK，并显示出AMPK信号受损。(A类)雄性和雌性小鼠肝裂解物中AMPK底物磷酸化的代表性免疫印迹。(B类)基于面板免疫印迹的AMPK底物磷酸化相对于总蛋白的半定量分析A类. ∗∗∗P（P）<0.0001，双向方差分析。误差条代表SD(C)新鲜冷冻肝脏切片用AMPK抗体染色(红色)闭塞小带1（ZO1）（绿色）在WT和CD73-LKO小鼠中的AMPK分布相似。底部面板：放大视图装箱区域.比例尺：50微米。(D类)在指定浓度下，用AMP和重组可溶性CD73（rCD73）处理分离的WT肝细胞。总蛋白和磷酸化AMPKα的代表性免疫印迹。(电子)磷酸化/总AMPK的量化。n=4个重复。**P（P）< .001; 双向方差分析。(F类)代表性免疫印迹分析显示，经AMP、rCD73和腺苷转运抑制剂硝基苄基硫代肌苷（NBTI）处理的WT肝细胞中AMPK磷酸化。(G公司)在缺乏/存在AMP和NBTI的情况下，定量rCD73处理的肝细胞中磷酸化/总AMPK。n=3次重复。双向方差分析。误差线表示SD.DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。
图8
图8
肝细胞CD73缺失导致自发性肝炎症。(A类)22周龄CD73-LKO小鼠肝脏炎症病变的典型H&E图像。装箱区域在中顶部面板在底部面板. (B类)定量门静脉和小叶炎症的盲法组织学分析（门静脉+小叶炎症动物的平均分数）。得分：0分，无；2，最小值；4、轻度；6、中度；8，严重。(C)男性（蓝色）和女性促炎标志物白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α的总肝信使RNA分析(红色)21～42周龄的小鼠。(D类)免疫组织化学染色石蜡包埋肝组织中性粒细胞标记物Ly6G的代表性图像(棕色的). 哈里斯苏木精染色细胞核（蓝色）。插入：放大视图装箱区显示信号分布。比例尺：200微米。(电子)Ly6G的定量+面板中每个视图字段的单元格D类. (F类)外核苷酸酶CD39的基因表达分析(嵌入式处理器1)和腺苷受体A1R、2AR、2BR和3R(阿多拉1,2a个,2亿,三)在雄性和雌性WT和LKO小鼠中使用总肝信使RNA。n=13个WT男性，n=12个LKO男性，n=14个WT女性，n=18个LKO-女性。*P（P）< .05, ∗∗P（P）< .01, ∗∗∗∗P（P）<0.0001，未配对t吨测试。误差条代表SD。
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