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.2021年3月18日；81（6）：1160-1169.e5。
doi:10.1016/j.molcel.2020.12.048。 Epub 2021年1月26日。

电压门控钠通道内的三苯氧胺受体

阿尔廷·苏拉 1, 大卫·霍林沃思 1, 利奥·C·T·Ng 2, 梅根·拉莫尔 2, 保罗·G·德卡昂 三, B A华莱士 4
附属公司

电压门控钠通道内的三苯氧胺受体

阿尔廷·苏拉等。 分子电池. .

摘要

电压门控钠通道是许多止痛药和抗癫痫药物的靶点，其治疗机制和结合位点已得到很好的表征。我们描述了NavMs电压门控钠通道内先前未识别的受体位点的鉴定。三苯氧胺是一种雌激素受体调节剂，其初级和次级代谢产物结合在通道的细胞内出口处，这是一个不同于其他先前表征的钠通道药物位点的位点。这些化合物以类似的效力抑制NavM和人钠通道，并通过延迟通道从失活状态恢复来阻止钠传导。因此，本研究不仅描述了一个可用于开发治疗钠通道病新药的位点的结构和药理学，还可能对这种广泛使用的治疗药物的非靶向健康效应产生重要影响。

关键词：通道病；晶体结构；药物结合；电生理学；雌激素受体；新型结合位点；非靶向药物效应；药理学；三苯氧胺；电压门控钠通道。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
NavMs钠通道复合物与三苯氧胺或其代谢产物的晶体结构概述每个面板的顶部对应于细胞外部，底部对应于细胞内部。细胞膜表面的大致位置用水平黑线表示。选择性过滤器中的三个钠离子显示为粉红色球体。在所有面板中，蛋白质以金带基序描述，结合的化合物以棒状表示（绿色，碳；红色，氧；蓝色，氮）。三苯氧胺或代谢物共有八个拷贝可以在四个对称相关位置的两组（指定为“内部”和“外部”）中结合到单个通道。所有这些复合物中的蛋白质结构基本相同，总RMSD范围为0.21到0.5Ω。（A） NavMs与4-羟基三苯氧胺复合物，指示药物在结构中所有八个拷贝（四个“内部”和四个“外部”位点）的位置。这说明了化合物在位于通道胞内出口上方的蛋白质空腔中的紧密堆积。（B） 如（A）所示，除了这描绘了（左）含有4-羟基三苯氧胺的野生型NavMs复合物和（右）F208L突变体（NavMsL（左）)与4-羟基三苯氧胺复合。对野生型和突变型蛋白质进行了比较，因为这种结合位点残基是对应的人类钠离子的两个结构域中的Fv（v）1.2蛋白质和L在人类蛋白质的其他两个域中（图S6）。为了清楚起见，在这些结构中，在两个不同的“内部”和“外部”位点中，每一个都只显示药物的一个拷贝。（C） 导航管理器L（左）显示（为清楚起见）仅一份三苯氧胺的“外”位点。（D） 如（C）所示，但这描述了NavML（左）与其他代谢物的复合物：（左）N-去甲基三苯氧胺位于“内部”位置和（右）NavMsL（左）在“内部”部位使用内昔芬。另请参见图S1和S6以及表S1。
图2
图2
三苯氧胺及其代谢物存在和不存在时NavMs结构的比较（A）载脂蛋白-NavMs单体多肽主干的重叠带状表示L（左）（灰色），他莫昔芬-NavMsL（左）（绿色），4-羟基三苯氧胺-NavMsL（左）（红色），N个-去甲基三苯氧胺-NavMsL（左）（珊瑚）和endoxifen-NavMsL（左）（蓝色），显示结合任何化合物时发生的多肽链的主要差异。尽管apo和结合结构的整体构象在其跨膜结构域中基本相同（总的C-αRMSD为1.35Å），但在所有复合结构中，从S6螺旋的C-末端开始，C-末端尾部与apo结构有很大不同（图底部）（残基I224）（用黑色圆圈表示）在残基P240处达到5.9 Au的RMSD，这是细胞内螺旋区（用橙色虚线框表示）之前的最后一个残基，明显偏离了apo结构中该区域的位置。所有复合物的其余多肽链结构基本相同（最大偏差为0.2–0.5º）。（B） 载脂蛋白-NavMs晶体结构（左）和4-羟基他莫西芬-NavMs复合物（右）的静电表面表征。该药物（用绿色棒状表示）仅在橙色方框内表示的C末端细胞内结构域上方的开口处可见。右下方的面板显示了穿过4-羟基三苯氧胺复合物中间的垂直切片，在跨膜通道孔的底部可以清楚地看到该化合物（绿色棒状表示）。这是一个不同于中央疏水腔（用黑匣子表示）及其下方的区域，中央疏水腔被认为是许多镇痛剂和麻醉剂化合物的结合位点。另请参见图S3。
图3
图3
4-羟基三苯氧胺-NVMs复合物中“内部”和“外部”结合位点的详细视图任何位点之间都没有空间位阻，因此可以同时占据所有八个位置。为了清楚起见，在该图中，每种类型的场地仅显示了四个等效位置中的一个。（A） “内部”绑定位置。左图：NavM的晶体结构（四条多肽链的带状描绘，颜色不同），其中4-羟基三苯氧胺分子在棒状描绘中覆盖（蓝色网格）（2Fo–Fc，轮廓为1.5σ）电子密度图。右图：两条不同多肽链（蓝色和珊瑚色）之间的结合位点及其位置的详细视图。（B） “内部”结合位点的更详细视图，显示覆盖蛋白质结构的4-羟基三苯氧胺的（2Fo–Fc，1.5σ等高线）电子密度图（蓝色网格），相邻的蛋白质侧链呈棒状描绘（用链着色，标记残数）。左右面板描绘了同一位置的两个视图，旋转以显示分子的清晰视图。（C和D）如（A）和（B）所示，除了用（2Fo–Fc，1σ等高线）电子密度图描绘“外部”位置。（E） NavMs、D220E和E227D突变通道产生的4-羟氨苄醚剂量-反应曲线，破坏了“内部”结合。n=在每个浓度下测试4个细胞，误差线等于SD。（F）与D220E和E227D突变体结合的4-羟基三苯氧胺自由能相对于WT-NVMs通道的变化。另请参见图S4。
图4
图4
功能研究显示转染（A）NavMs或（B）hNa的三苯氧胺类似物（A和B）HEK293细胞抑制钠电流v（v）1.2在全细胞配置中被电压捕获。示例电压门控钠电流（I纳)记录在对照条件下和细胞外三苯氧胺衍生物浓度增加的情况下。电流由指示电位（灰色）的0.5 Hz去极化序列激活，I纳在每种条件下2min后评估抑制作用。右侧面板：产生的药物浓度百分比钠电流抑制（%I纳抑制）关系符合希尔方程，以估算半最大抑制浓度（IC50). 误差条等于1 SD，每种药物浓度测试四到七个细胞。
图5
图5
雌激素受体和NavMs通道中三苯氧胺的结合及其对腺癌细胞记录的钠电流的抑制（A）NavMs中4-羟基三苯氧酚结合位点重叠的立体图像（PDB：6SXC型)（深绿色）和雌激素受体（深粉红色）（PDB:3ERT（应急响应小组）). 这显示了结合位点几何结构和形成氢键的残基（一端为Asp，另一端为Glu）的相似性，这些氢键参与了化合物与两种靶蛋白的相互作用（如相应的浅绿色和浅粉色棒图所示）。NavMs和雌激素受体蛋白分子的侧链分别用深绿色和深粉红色表示。（B） 腺癌细胞系MDA-MB-231细胞记录的内源性钠电流。左：通过在TTX治疗前后将去极化电位从−100 mV的保持电位连续增加5 mV来激活样本电压门控钠电流。右：作为电压函数绘制的结果电流密度。（C） 左：示例I纳从MDA-MB-231细胞中记录，并使用图4中描述的相同方案通过4-羟基三苯氧胺对其进行抑制。右，TTX和4-羟基三苯氧胺的药物浓度-钠电流抑制百分比关系如图4所示。误差条表示SD，测试的单元格数量用括号表示。另请参见图S2。
图6
图6
通过4-羟基他莫昔芬电压方案抑制NavMs钠电流的机制显示在每个面板上方。（A） 起始值（τ在)和回收率（τ远离的)在指定条件下，从表达NavMs的电压钳制HEK细胞中记录到4-羟基三苯氧胺的抑制作用。顶部：示例NavMs I纳（黑色）在用药前、用药期间和用药后通过150 ms从−180 mV去极化激活。（B） 在添加和去除100μM Cd后，通过单指数拟合估算时间常数2+或3μM 4-羟基三苯氧胺。（C和D）4-羟氨苄醚对NavMs钠电流的抑制依赖于进入失活状态。图中显示了样本细胞在0.5 Hz（C）150 ms和（D）7 ms 0 mV去极化序列下钠电流峰值抑制的时间进程，其中97%和6%的I纳脉搏结束时被激活(我不正确的)分别是。细胞外1μM 4-羟基三苯氧胺应用1分钟（蓝色区域），同时细胞保持在−180 mV，此时NavMs通道保持在闭合状态。细胞被送回对照灌注液，并使用相同的电压方案去极化。（E） 比较用7或150 ms去极化电压方案去极化的细胞中4-羟基三苯氧胺对钠电流的抑制百分比。误差条表示SD，括号中显示了针对每个条件（n）测试的单元格数量。（F） 提出三苯氧胺及其代谢物抑制钠通道的模型。三苯氧胺与钠通道结合，但不阻断离子传导孔。钠通道的药物占用会损害失活状态的恢复，导致可通过后续去极化重新打开的通道更少。本图中使用的钠通道模型基于开放apoNavM（PDB：5个HVX)并关闭apo NavAb（PDB:5VB2型). 另请参见图S5。
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