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.2021年3月；47(3):15.
doi:10.3892/ijmm.2021.4848。 Epub 2021年1月15日。

利用脂肪源性干细胞释放特异性分泌体治疗乙型肝炎

Hee Ju Kim先生 1, Ok-Hee Kim（你好，金） 1, Ha-Eun Hong公司 1, 李相哲 2, 赛义·琼·金 1
附属公司

利用脂肪源性干细胞释放特异性分泌体治疗乙型肝炎

Hee Ju Kim先生等。 国际分子医学杂志. 2021年3月.

摘要

间充质干细胞（MSCs）具有修复受损组织的功能，这是由分泌体介导的，分泌体是MSCs分泌物质的集合。调整MSCs的培养条件可以导致分泌体的组成发生显著差异。据推测，使用特定致病剂对MSC进行预致敏可以利用MSC释放专门用于该疾病的治疗材料。为了验证这一假设，本研究旨在利用乙型肝炎病毒抗原（HBx）作为致病物质，为乙型肝炎病毒引起的肝炎生成一种“疾病特异性分泌体”。在脂肪源性干细胞（ASC）被100倍稀释的AML12肝细胞培养液刺激后收集秘书材料（HBx‑IS），该培养液已被pcDNA‑HBx转染24小时，随后，给小鼠静脉注射对照分泌组（CS）或HBx‑IS。与CS注射液相比，HBx‑IS注射液显著降低了血清白细胞介素-6和肿瘤坏死因子‑α（促炎细胞因子）的水平。肝脏标本的蛋白质印迹分析和免疫组织化学显示，HBx‑IS注射导致肝脏再生相关标志物（包括肝细胞生长因子和增殖细胞核抗原）的表达增加，促凋亡标志物（如小鼠肝脏中裂解的胱天蛋白酶3和Bim）的表达减少，与CS注射液相比，促炎标记物（F4/80和CD68）的表达较低。与CS相比，HBx‑IS表现出更高的肝脏再生、抗炎和抗凋亡特性，尤其是在乙型肝炎小鼠模型中。这表明，通过用致病剂刺激ASC获得的分泌体对特定疾病的治疗效果可能比单纯分泌体更显著。

关键词：脂肪源性干细胞；乙型肝炎病毒；乙型肝炎病毒抗原；间充质干细胞；分泌组。

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数字

图1
图1
研究设计概述。（A） 建模和干预计划。（B） 研究设计。每周经尾静脉注射pcDNA-HBx制备小鼠乙型肝炎模型，共6周。通过尾静脉分别注射CS、HBx-DS和HBx-IS四次（每周两次，持续两周），实现干预。乙型肝炎病毒蛋白X；CS，对照分泌组；HBx-IS，间接HBx-诱导分泌体；HBx-DS，直接HBx诱导分泌体；i分泌体，诱导分泌体。
图2
图2
验证HBx转染和HBx异分泌物对反映肝再生的mRNA表达的影响。（A）体外HBx转染的验证。RT-qPCR结果显示转染的AML12细胞和ASC中HBx-mRNA表达较高（均P<0.05）。（B）体内HBx转染的验证。RT-qPCR结果显示，经尾静脉注射pcDNA-HBx的小鼠肝组织中HBx-mRNA表达较高（P<0.05）。（C） 每种治疗的典型组织学比较。分别对HBx诱导的肝炎小鼠静脉注射CS、HBx-DS和HBx-IS。H&E染色显示，与HBx-DS输注相比，HBx-IS输注能够更好地恢复肝组织。（D） RT-qPCR结果显示单独治疗后HGF和VEGF的mRNA表达。与CS注射相比，HBx-DS注射并未增加乙型肝炎小鼠HGF和VEGF mRNA的表达。然而，与CS注射相比较，HBx-IS注射给乙型肝炎小鼠显著增加了HGF及VEGF的mRNA表达。数值表示为3个独立实验的平均值±标准偏差。*P＜0.05。ASCs，脂肪源性干细胞；乙型肝炎病毒蛋白X；CS，对照分泌组；CV，控制向量；HBx-IS，间接HBx-诱导分泌体；HBx-DS，直接HBx诱导分泌体；肝细胞生长因子；血管内皮生长因子。
图3
图3
HBx isecretome对血清肝酶和促炎细胞因子水平的影响。（A） 每次治疗后肝酶血清水平的比较。（B） EILSA结果显示每次治疗后血清促炎细胞因子水平。数值表示为3个独立实验的平均值±标准偏差。*P＜0.05。丙氨酸转氨酶；天冬氨酸转氨酶；乙型肝炎病毒蛋白X；CS，控制分泌体；HBx-IS，间接HBx-诱导分泌体；HBx-DS，直接HBx诱导分泌体；TNF-α、肿瘤坏死因子-α。
图4
图4
HBx isecretome对反映肝脏再生的蛋白质表达的影响。（A） 顶部面板说明了HBx-DS对反映肝再生的蛋白质表达的影响。在乙型肝炎小鼠中，与CS相比，HBx-DS没有显著增加这些肝脏再生相关蛋白的表达。底部面板显示了反映各组肝脏再生的蛋白质相对密度。（B） 顶部面板说明了HBx-IS对反映肝再生的蛋白质表达的影响。与CS相比，HBx-IS显著增加了p-STAT3/t-STAT3和PCNA的表达。底部面板显示了反映各组肝脏再生的蛋白质相对密度。数值表示为3个独立实验的平均值±标准偏差。*P＜0.05。使用Image Lab软件量化单个标记物的相对密度，然后将其归一化为各组的β-actin相对密度。乙型肝炎病毒蛋白X；CS，控制分泌体；HBx-IS，间接HBx-诱导分泌体；HBx-DS，直接HBx诱导分泌体；肝细胞生长因子；增殖细胞核抗原；信号转导子和转录激活子3；血管内皮生长因子。
图5
图5
HBx-异分泌物对凋亡相关蛋白表达的影响。（A） 顶面板说明HBx-DS对凋亡相关蛋白表达的影响。在患有乙型肝炎的小鼠中，与CS相比，HBx-DS显著增加了某些促凋亡标志物（c-caspase 3和BIM）的表达，并显著降低了Mcl-1的表达。底部面板显示了各组中凋亡相关蛋白的相对密度。（B） 顶部面板说明了HBx-IS对凋亡相关蛋白表达的影响。与CS相比，HBx-IS显著降低了所有检测的促凋亡标记物的表达（P<0.05），而Mcl-1的增加不显著。底部面板显示了各组中凋亡相关蛋白的相对密度。数值表示为3个独立实验的平均值±标准偏差。使用Image Lab软件对单个标记物的相对密度进行量化，然后将其归一化为各组中β-肌动蛋白的相对密度。*P＜0.05。BIM、Bcl-2样蛋白11；乙型肝炎病毒蛋白X；c-Cas3，裂解caspase-3；CS，控制分泌体；HBx-IS，间接HBx-诱导分泌体；HBx-DS，直接HBx诱导分泌体；Mcl-1，髓细胞白血病1；PARP，poly-ADP（二磷酸腺苷）-核糖聚合酶。
图6
图6
HBx isecretome给药后肝脏的免疫组织化学染色。（A） 左面板显示了每次治疗后肝脏的VEGF免疫组化。注射CS和HBx-IS均显著增加肝脏中VEGF的表达。此外，HBx-IS组VEGF的表达显著高于CS组。右侧面板显示VEGF免疫反应区的百分比。（B） 左面板显示了每次治疗后肝脏的Bcl-xL免疫组化。注射CS和HBx-IS均显著增加肝脏中Bcl-xL的表达。此外，HBx-IS组中Bcl-xL的表达显著高于CS组。右侧面板显示Bcl-xL免疫反应区的百分比。（C） 左图显示了每次治疗后肝脏的γ-GTP免疫组化。注射CS和HBx-IS均显著降低肝脏中γ-GTP的表达。当比较CS和HBx-IS、HBx-IS时，HBx-IS组的γ-GTP表达显著低于CS组。右侧显示γ-GTP免疫反应区的百分比。数值表示为3个独立实验的平均值±标准偏差。用NIH图像J测量免疫反应区的百分比，并表示为与正常肝脏的相对值。*P＜0.05。Bcl-xL，B细胞白血病-超大；乙型肝炎病毒蛋白X；CS，控制分泌体；γ-GTP，γ-谷氨酰转肽酶；HBx-IS，间接HBx-诱导分泌体；HBx-DS，直接由HBx诱导的分泌组；血管内皮生长因子。
图7
图7
服用HBx后肝脏的免疫荧光。（A） 左面板显示了每次治疗后肝脏的F4/80免疫荧光。右图显示了F4/80免疫反应区域的百分比。注射CS和HBx-IS均显著降低肝脏中F4/80的表达。此外，HBx-IS组F4/80的表达显著低于CS组。（B） 左面板显示了每次治疗后肝脏的CD68免疫荧光。右侧显示CD68免疫反应区的百分比。注射CS和HBx-IS均显著降低肝脏中CD68的表达。此外，HBx-IS组CD68的表达显著低于CS组。数值表示为3个独立实验的平均值±标准偏差。用NIH图像J测量免疫反应区的百分比，并表示为与正常肝脏的相对值。*P＜0.05。乙型肝炎病毒蛋白X；CS，控制分泌体；HBx-IS，间接HBx诱导的分泌组；HBx-DS，直接HBx诱导分泌体。
图8
图8
验证HBx-异分泌物的疾病特异性。将TAA诱导的肝衰竭小鼠分别静脉输注对照分泌组、TAA分泌组和HBx分泌组。肝脏的Western blot分析显示，TAA-等分泌组而非HBx-等分泌，诱导了增殖标记物（HGF、VEGF和PCNA）的高表达（均P<0.05）。数值表示为3个独立实验的平均值±标准偏差。*P＜0.05。使用Image Lab软件量化单个标记物的相对密度，然后将其归一化为各组的β-actin相对密度。CS，控制分泌体；Ct，对照；乙型肝炎病毒蛋白X；HBx-IS，间接HBx-诱导分泌体；肝细胞生长因子；增殖细胞核抗原；TAA，硫代乙酰胺；硫代乙酰胺诱导分泌体；血管内皮生长因子。
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