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.2020年12月14日；18（12）：e3001008。
doi:10.1371/journal.pbio.3001008。 eCollection 2020年12月。

多发性硬化脑正常白质（NAWM）中的神经炎症导致Ranvier淋巴结异常

帕特里夏·加列戈·德尔加多 1, 雷切尔·詹姆斯 1, 埃莉诺·布朗 1, 乔安娜·孟 1, 斯韦莎·乌马尚卡 1, 李坦 1, 卡门·皮肯 1, 尼古拉斯·D·马扎拉基斯 1, 阿尔多·费萨尔 2 三 4, 欧文·W·豪厄尔 1 5, 理查德雷诺兹 1 6
附属公司

多发性硬化脑正常白质（NAWM）中的神经炎症导致Ranvier淋巴结异常

帕特里夏·加列戈·德尔加多等人。 公共科学图书馆生物. .

摘要

多发性硬化（MS）大脑正常白质（NAWM）中Ranvier淋巴结结构的改变与慢性炎症有关。我们发现MS NAWM的偏执域平均比对照长，Kv1.2通道错位为偏执。通过注射淋巴毒素-α（LTα）和干扰素-γ（IFNγ）基因的慢病毒载体，在慢性脑膜炎模型中再现了这些病理特征。我们发现，肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素γ和谷氨酸可以在小脑片培养中引起偏执性延长，而N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体阻滞剂可以逆转这种延长。当将这些变化插入计算模型以模拟轴突传导时，观察到速度迅速下降，小直径轴突的传导失败。我们认为，由促炎细胞因子激活的胶质细胞可以产生高水平的谷氨酸，从而触发偏执病理，导致轴突损伤和传导缺陷。

PubMed免责声明

利益冲突声明

我已经阅读了该杂志的政策，本手稿的作者有以下竞争利益：PG、RJ、EB、JM、SU和CP没有竞争利益。RR已从MedImmune plc获得研究资金，并从罗氏和诺华获得咨询费。OWH已收到罗氏公司的咨询费。

数字

图1
图1。MS NAWM区域包含更多与激活的小胶质细胞相关的拉长偏执狂。
（A） 使用抗-MOG-髓磷脂免疫荧光法确定脱髓鞘和正常髓磷脂出现的区域。NAWM感兴趣区域（i，ii）被选为远离脱髓鞘病变的区域（iii，iv）。（B） 在整个NAWM感兴趣区域中发现了具有活化形态的抗HLA-DR+小胶质细胞突起簇，并在第i至iv组中以较高放大率进行了图示。（C） 横断面上单个Caspr1染色偏执狂的共焦图像及其强度分布。（D，E）来自人类死后非神经控制组（D）和NAWM MS组织（E）的偏执狂共焦图像。（F） 与非神经控制组织相比，NAWM MS组织中Caspr1+偏执长度的分布存在显著差异(第页<0.0001，Mann-Whitney检验）。（G） NAWM MS组织中Caspr1+偏执狂的比例大于对照组织中的4μm和5μm。（H） 每个区块的平均偏执型长度与HLA-DR+小胶质细胞/巨噬细胞占据的平均面积相关（r=0.43*第页<0.5，斯皮尔曼秩相关检验）。（一） 每个区块HLA-DR+小胶质细胞/巨噬细胞所占的平均面积与大于4μm偏执狂的比例相关（r=0.46**第页<0.01，斯皮尔曼秩相关检验）。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白；MS，多发性硬化；NAWM，正常的白质。复制此图的数据和代码可以在以下位置找到：https://github.com/PatGal2020/PLOS_submission网站
图2
图2。结旁延长与SMI32+轴突和并列帕帕阳极电压门控Kv1.2通道错位有关。
（A） 长Caspr1+偏执狂与SMI32抗体共同染色的共焦图像。以去磷酸化神经丝为特征的SMI32+轴突具有拉长的偏执。（B） 来自MS NAWM和非神经控制组织的SMI32+和SMI32-轴突的副节段长度分布(****第页<0.0001，Mann–Whitney试验）。（C） 来自淋巴结的共焦图像，显示副极（红色）和K中Caspr1的表达v（v）1.2在非病理条件和相应的RGB配置文件下，并排帕帕阳极（绿色）中的通道不重叠。（D） Caspr1和K所在节点的共焦图像v（v）1.2为共定位，因此可能受到MS神经病理学条件及其强度RGB分布的影响。紫色圆圈表示两个信号共同定位的区域：重叠区域。（E） 当Caspr1和K之间的差异v（v）1.2信号小于可变强度阈值，我们将该点视为重叠区域。对于每个计算的阈值，MS NAWM组织（蓝色）中重叠区域的比例大于非神经控制组织（灰色）。（F） 每个区块的平均偏执长度与强度阈值为50时重叠区域的比例相关（r=0.49**第页<0.01，斯皮尔曼秩相关检验）。（G） 每个区块大于4μm偏执狂的比例与阈值为50时重叠区域的比例相关（r=0.57***第页<0.001，斯皮尔曼秩相关检验）。MS，多发性硬化；NAWM，正常的白质。复制此图的数据和代码可以在以下位置找到：https://github.com/PatGal2020/PLOS_submission网站.
图3
图3。与GFP和naive相比，受LTα/IFNγ影响的大鼠组织中含有更长的Caspr1-偏执狂的比例更高。
（A–C）MOG染色的胼胝体、扣带回和LTα/IFNγ、GFP和幼年大鼠的外膜的免疫荧光图像。（D） Caspr1-K的共焦图像v（v）LTα/IFNγ大鼠的1.2种偏执狂和并列帕帕肽。（E–G）单个Caspr1-K的共焦图像v（v）LTα/IFNγ大鼠的1.2种偏执狂和并列帕帕肽。（H） Caspr1-测量LTα/IFNγ（蓝色）、GFP（橙色）和天真（灰色）大鼠组的偏执长度分布(****第页<0.0001，Mann–Whitney试验）。（一） 副节段长度数据被划分为不同的长度范围，并用条形图表示。LTα/IFNγ载体注射的大脑中含有大于3μm和4μm的偏执狂的比例更大。（J） 共聚焦图像中Caspr1染色的paranodes与K共聚焦v（v）1.2色并排阳极。为了量化通道的位移，获得了每个偏执和并列通道的RGB强度分布。紫色圆圈表示两个信号共同定位的区域。（K） 显示Caspr1和K之间重叠区域比例的图表v（v）1.2与GFP组和单纯组相比，LTα/IFNγ组在每个强度阈值下的RGB信号更大。（五十） 当强度阈值设置为50时，平均偏执长度与重叠区域的比例显著相关（r=0.827**第页＜0.01，Spearman秩相关检验）。绿色荧光蛋白；干扰素γ；LTα，淋巴毒素-α；MOG，髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白。复制此图的数据和代码可以在以下位置找到：https://github.com/PatGal2020/PLOS_submission网站.
图4
图4。结旁延长和Kv1.2脱位同时发生，它们与胶质细胞激活有关。
（A–C）LTα-IFNγ、GFP和幼年大鼠胼胝体IBA1+小胶质细胞（红色）的免疫荧光图像。插图显示，与GFP对照组和幼年动物相比，细胞因子载体注射动物中的小胶质细胞（以绿色显示）显示出高度激活的形态。（D–F）LTα/IFNγ、GFP和幼年大鼠胼胝体GFAP+星形胶质细胞的免疫荧光图像。（G） 小胶质细胞的数量与每只大鼠的平均偏执长度相关（r=0.62*第页<0.05，斯皮尔曼秩相关检验）。（H） 小胶质细胞的数量与Caspr1和K之间重叠区域的比例相关v（v）1.2当强度阈值设置为50（r=0.778**第页＜0.01，Spearman秩相关检验）。（一） 星形胶质细胞的数量与每只大鼠的平均偏执长度相关（r=0.69*第页<0.05，斯皮尔曼秩相关检验）。（J） 星形胶质细胞的数量与Caspr1和K重叠区域的比例相关v（v）1.2当强度阈值设置为50（r=0.75*第页<0.05，斯皮尔曼秩相关检验）。绿色荧光蛋白；干扰素γ；LTα，淋巴毒素-α。复制此图的数据和代码可以在以下位置找到：https://github.com/PatGal2020/PLOS_submission网站.
图5
图5。TNF-IFNγ激活的小胶质细胞释放大量谷氨酸。
（A） 未经处理的原代小胶质细胞培养物的实时图像，（B）48小时后用IFNγ处理的培养物，（C）48小时以后用TNF处理的培养液，以及（D）48小时之后用TNF/IFNγ处理过的培养物（E，F）复制品中谷氨酸水平的平均值±SEM，显示对照组和细胞因子处理之间的统计差异：（E）100 ng/ml(n个=3控制，n个=3 TNF，n个=3干扰素γ，n个=3 TNF/IFNγ），（F）2次100 ng/ml的急性治疗(n个=3控制，n个=3肿瘤坏死因子，n个=3干扰素γ，n个=4 TNF/IFNγ）。对细胞因子组和时间进行非参数Friedman检验，并对比较组进行事后配对Wilcoxon检验(*第页< 0.05, **第页< 0.01). 干扰素γ；TNF、肿瘤坏死因子。复制此图的数据和代码可以在以下位置找到：https://github.com/PatGal2020/PLOS_submission网站.
图6
图6。经促炎细胞因子和谷氨酸处理的小脑组织切片中拉长偏执狂的比例。
（A） 来自未经处理的小脑培养物的Caspr1染色偏执狂的共焦图像，用3剂量50 ng/ml TNF/IFNγ处理的切片，用2剂量100 ng/ml的TNF/IFFγ处理的薄片，用2个剂量75μM谷氨酸处理的切片，和用2剂量小胶质细胞条件培养基处理的切片（用2剂量100 ng/ml TNF/IFNγ处理的原代小胶质细胞培养基）；星号指向长期且混乱的偏执狂。（B） 方框图显示了处理和未处理培养物之间不同的副节点长度分布（非参数Kruskal–Wallis检验和事后Wilcoxon秩和检验****第页< 0.0001). （C） 相同偏执长度分布的条形图显示了不同长度的每个数据集中偏执的比例。（D） 非处理培养物（橙色）的偏执长度分布方框图，2剂100 ng/ml TNF+IFNγ与MK-801（深灰色），2剂单独100 ng/mlTNF+干扰素γ（浅灰色）(****第页<0.0001，Mann–Whitney试验）。（E） 条形图显示划分为不同长度范围的相同偏执长度分布。干扰素γ；TNF、肿瘤坏死因子。复制此图的数据和代码可以在以下位置找到：https://github.com/PatGal2020/PLOS_submission网站.
图7
图7。用于模拟21节有髓鞘轴突的结构和生物物理参数。
（A） 模型的双电缆电路用于表示轴膜（Ga）、外膜间隙（Gp）和髓鞘（Gm），使用模拟器NEURON生成。具体而言，创建了21个节点、39个偏执、39个并排和20个节点间隔间。（B） 模型中使用的解剖参数。从猕猴EM研究的CNS测量值中选择了七种直径[42]，根据0.0156μm的髓磷脂周期值计算髓磷脂板层的数量[71]，根据大鼠神经纤维测量的线性关系计算节点间的长度[72]，根据猫腹根的直径依赖性标度关系推断出近顶长度[73]，并根据我们的非神经控制病例测量的Caspr1染色平均值确定偏侧长度。（C） 生物物理参数。轴突电容基于大鼠腹根[86]的数据，髓鞘电容和每个板层的漏电导基于青蛙坐骨神经[87]。电阻率设置为1000欧姆*cm2每个髓鞘板[40,87,88,89,90,91]。（D） 图中显示了模型在模拟的7种纤维直径上的传导速度（蓝色），以及猫后肢神经中测得的速度数据[43]。
图8
图8。偏执型分裂对AP传导的影响与轴突直径成反比。
（A） 图中表示了随着偏执型周围空间的增加，偏执型边缘空间的增量以及每个核心直径处的归一化速度图。（B） 图中表示了随着偏执和近交周间隙的增加，每个核心直径处的偏执和旁交周间隙增量以及归一化速度图。（C） 表示偏执型和近侧型肛门周和肛门周K增量的图v（v）1个位错和在每个核心直径处的归一化速度图，随着偏斜周间隙的增加。（D） 表示偏执型和近侧型肛门周和肛门周K增量的图v（v）1个位错和在每个核心直径处的归一化速度图，随着偏斜周间隙的增加。（E） 在核心直径为0.4μm的轴突模型中，当5个连续的节点被破坏（橙色）时，发生传导故障，并且横突和近筋膜周围间隙宽度分别增加到0.012和0.12μm。此外，在不同的中断模式下，速度可能会衰减，传导可能会失败（橙色表示中断节点，紫色表示健康节点，红色表示传导失败）。
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