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.2020年12月9日；108（5）：919-936.e11。
doi:10.1016/j.neuron.2020.08.030。 Epub 2020年9月24日。

LTP诱导通过促使突触周围星形胶质细胞退缩促进谷氨酸溢出

克里斯蒂安·亨尼伯格 1, 露西·巴德 2, Aude Panatier公司 三, 詹姆斯·P·雷诺兹 2, 奥尔加·科帕赫 2, 尼古拉·梅德韦杰夫一世 4, 丹尼尔·明格 5, 米歇尔·赫德 5, 斯蒂芬妮·安德斯 5, 伊戈尔·克拉夫 4, 贾诺什·P·海勒 2, 西尔万·拉玛 2, 郑凯宇 2, 托马斯·詹森 2, 桑切斯·罗梅罗 6, 科林·J·杰克逊 7, 哈拉尔德·贾诺夫贾克 8, 奥利·彼得·奥特森 9, 埃伦德·阿努夫·纳格尔胡斯（Erlend Arnulf Nagelhus） 10, 史蒂芬·H·R·奥利特 11, 迈克尔·G·斯图尔特 12, U Valentin Nägerl先生 13, 德米特里·阿鲁萨科夫 14
附属公司

LTP诱导通过促使突触周围星形胶质细胞退缩促进谷氨酸溢出

克里斯蒂安·亨尼伯格等人。 神经元. .

摘要

谷氨酸的突触外作用受到突触前星形胶质细胞过程（PAPs）表达的高亲和力转运蛋白的限制：这有助于维持兴奋回路中的点对点传递。大脑中的记忆形成与突触重塑有关，但这如何影响PAP，因此突触外谷氨酸的作用尚不清楚。在这里，我们使用先进的成像方法，在原位和体内，发现经典的突触记忆机制，长期增强（LTP），触发PAP从增强的突触中退出。光学谷氨酸传感器结合斑贴和3D分子定位显示，LTP诱导导致星形胶质细胞谷氨酸转运体的空间退缩，促进谷氨酸溢出和NMDA受体介导的突触间串扰。LTP触发的PAP退出涉及NKCC1转运体和肌动蛋白控制蛋白cofilin，但不依赖于主要钙2+-星形胶质细胞中的依赖性级联。因此，我们发现了一种机制，通过这种机制，一个突触的记忆轨迹可以改变多个相邻连接的信号处理。

关键词：兴奋性突触；星形胶质细胞可塑性；桶皮层；谷氨酸传感器成像；谷氨酸溢出；海马；长期增强；突触周星形胶质突起；超分辨显微镜；触须刺激。

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利益声明作者声明没有竞争利益。

数字

图1
图1
CA3-CA1突触LTP诱导后PAP减少（A）左侧：2PE点扩散功能（PSF）激发~1μm焦平面内的染料填充PAP（黄色，3D EM片段）（虚线；底部）。右：ROI内的荧光(F类投资回报率)PAP心室颤动评分，在5–7μm宽的躯体内达到~100%心室颤动(F类S公司). （B） AF 594填充星形胶质细胞（单焦点截面；λx个2P（P）=800 nm）；虚线圆锥体，细胞外记录吸管。F类投资回报率和F类S公司，VF读数区域；有关扩展动态范围的信息，请参见视频S1。（C） 痕迹，辐射状链球菌fEPSP，在LTP诱导前（前）和诱导后约25分钟；图表，相对fEPSP斜率（平均值±SEM；箭头，诱导开始）；∗∗∗p<0.001（诱导后25–30分钟：与基线相比为151.0%±6.7%，n=18）。（D） 对照组（绿色；n=24个细胞）和LTP诱导期间（箭头，开始；橙色；n=29）PAP VF的相对变化（%，平均±95%置信区间[CI]）；红线，最适合指数衰减到稳态V（V）F类(t吨)=V（V）F类秒秒+(1−V（V）F类秒秒)经验(−t吨/τ);心室颤动不锈钢=0.77±0.04，τ=14±5分钟。（E） 对照组（n=8个细胞）和LTP诱导后约25分钟（橙色；n=13；∗第页<0.05,**第页<0.01，与对照组相比，df=19）。（F） 如图所示，在低渗（220 mOsm/L）和高渗（420 mOsm/L）溶液中，PAP VF变化（%，所示样本量n）呈灰色。对照组（LTP，平均值±SEM:−25%±7%）、50μM APV（+APV，3.1%±9.9%）、无HFS（−0.8%±7.3%）、Ca2+夹钳（Ca夹钳，6.8%±9.5%），在Ca下2+添加10μM D-丝氨酸的夹钳（Ca-clamp+D-ser，−24%±7%）；**p<0.01；∗p<0.05；点，单个细胞。（G） 使用透析AF 594的FRAP评估星形胶质细胞内的扩散耦合（STAR方法；单焦点切片；~80μm深度）；箭头，示例行扫描位置。（H） 顶部：行扫描，如（G）所示（基线条件；灰度段，快门关闭）。底部：相应的荧光时间过程，在LTP诱导（LTP）之前（Cntrl）和之后约20分钟；F类0，初始强度；箭头所示，关闭期间的FRAP（完全恢复需要39–40秒）。（一） FRAP测试总结（G和H）；如图所示，LTP诱导可能使PAP减弱扩散耦合。图形（平均值±SEM），相对于基线的FRAP率（左纵坐标）：LTP诱导后约25分钟（LTP，62%±12%，n=11；∗第页<0.05); 在50μM APV中（108%±32%，n=7）；无-HFS对照（87%±15%，n=7）。灰色（右纵坐标），诱导后25分钟细胞外扩散率变化（LTP-ECS；104%±7%，n=5；图S1F-S1H）；点，单独测试。
图2
图2
如图所示，LTP诱导前后约25分钟，树突棘（红色，CA1锥体细胞；Thy1-YFP）和附近星形胶质细胞（绿色；600μM AF 488）的STED活体图像和相关3D EM报告PAP退出；圆形，ROI以脊椎头部为中心。（B） LTP诱导降低ROI内的绿/红（星形胶质细胞/神经元）像素比率（G/R；平均值±SEM；31%±10%，n=22，**第页<0.01），对红色像素计数没有影响（R；−3.1%±3.8%；∗与G/R变化相比p<0.02，df=42）；点，单个ROI。（C） 靠近（绿色）和远离（灰色）PAP的树突状棘的比例，对照组（Cntrl），诱导后20–25分钟（LTP），后者具有50μM APV（+APV）；所示脊柱编号（图S2A–S2D）。（D） 荧光（左）和DIC通道DAB转换后（右）所示的含有生物细胞素的斑片星形胶质细胞（箭头所示，局部星形胶质细胞通过缝隙连接染色）。（E） 电子显微照片显示，修补后的星形胶质细胞的PAP（D中的箭头）充满沉淀物（蓝色），相邻的树突棘（黄色）具有PSD。（F） 3D重建的星形胶质细胞片段（青色），包括相邻的薄（白色）和蘑菇状（黄色）树突棘，伴有PSD（红色；图S2E）。（G） 突触星形胶质细胞覆盖的体积测量：PAP VF是在以PSD（红色）为中心的100 nm厚同心3D壳（圆形，不按比例）内计算的。（H） 如图所示，对照组和LTP诱导后约30分钟，薄棘和蘑菇棘PSD周围的PAP心室颤动（平均值±SEM）；所示样品尺寸；∗∗∗p<0.001（蘑菇df=86，薄棘df=241）。
图3
图3
LTP相关PAP退出依赖于NKCC1和Cofilin（A）左上角：星形胶质细胞片段（5μm z堆栈）；圆圈，无槽点（400μM NPE-IP三; AF 594通道，λx个2相=840 nm）。其他面板：Ca2+IP响应（200μM Fluo-4；假色）三点陷（t=0；5 Hz时5 ms脉冲；λu个2相=720纳米）；显示时间推移；圆，Ca的ROI2+.（B）细胞内钙的时间进程2+信号（ΔF类/G公司)ROI，如（A）所示；单细胞示例；红色箭头（灰色段），IP三无盖。（C） 细胞内IP点滴后25分钟PAP VF的相对变化（%，平均值±SEM）三（-1.4%±4.1%，n=10），应用DHPG（300μM，3.5%±3.9%，n=10），CB1受体激动剂WIN55（1μM，4.1%±0.4%，n=3），或GABA受体激动剂麝香醇（20μM，0.4%±1.7%，n=6）。（D） LTP诱导后约25分钟PAP VF的相对变化（%，平均值±SEM；顶部），以及相应的LTP水平（%，均值±SEM，底部，所示样本量）：在存在0.5–0.7 U/mL软骨素酶ABC（ChABC，−14%±3%）的情况下，对照组ChABC-c（−11%±7%），10μg/mL EphA4-Fc（-17%±3%），10µg/mL Fc对照组（−20%±2%），野生型C57BI6小鼠（-17%±3%），AQP4−/−敲除小鼠（−18%±2%），20μM细胞内布美他尼（Bmtnd，−4%±4.5%+，−5.5%±2.7%），DMSO控制0.2%外部+0.05%内部（−19%±2%）；蓝色文本，来自小鼠的数据；灰色阴影，控制条件下LTP诱导后PAP心室颤动变化的95%置信区间；∗p<0.02（对于AQP4，df=12−/与Bmtnd相比，Bmtnd与DMSO的df=9），∗∗∗p<0.005（对于AQP4，df=13−/与Bmtnd+，对于Bmtnd+与DMSO，df=10；t检验或Mann-Whitney独立样本检验）。（E） 如图所示，在（D）所示的关键测试中，LTP诱导期间的PAP心室颤动变化（%，平均值±SEM），以及其他实验的总结（休息）。（F） 对照组（n=10）和星形胶质细胞内S3肽（200μM，n=6）的CA3-CA1突触LTP诱导期间的相对fEPSP斜率（平均值±SEM），如图所示（图S3B和S3C）。（G） 闭塞实验：PAP心室颤动变化（%，平均值±SEM，所示样本量）：对照组LTP诱导后约25分钟（LTP无S3；−23%±3%），无LTP诱导，全细胞负载S3（S3无LTP；−29%±6%）；相同但在缺乏S3的间隙连接星形胶质细胞中记录到（S3-GJ细胞；-0.4%±2.4%）；用S3诱导LTP后约25分钟（S3和LTP；-27%±3%）；∗∗∗p<0.001（df=13表示“LTP无S3”，而df=12表示“S3 GJ细胞”）。（H） 咬合实验中PAP VF的时间进程（%，平均值±SEM），如（G）所示；如（G）中的符号。
图4
图4
单个CA3-CA1突触的LTP诱导减少了局部PAP的存在（A）树突状片段、CA1锥体细胞（AF 594通道），在LTP诱导前（前）和诱导后（后）约20分钟显示出谷氨酸无钙化斑点（红点；2.5 mM深浴应用的MNI-谷氨酸）。（B） 一棵树的例子。痕迹、EPSC(我同步器，电压指示灯）基线检查时（黑色）和LTP诱导后约30分钟（红色；Ca见图S4A和S4B2+动力学）。图，相对EPSC振幅(我同步器; 黑色和红色圆圈）和电池接入电阻(对一，绿色）时间进程；箭头，LTP诱导开始。（C） （A）和（B）中实验的统计总结（平均值±SEM；n=7，∗∗∗p<0.005）；（B）中的符号；点，单独测试。（D） 例如，星形胶质细胞碎片（全细胞AF 594，单焦点切片）；红点、谷氨酸开斑；圆圈，ROI用于近距离PAP VF监测，如图所示。（E） 时间间隔帧（D中显示的区域）：星形胶质细胞Ca2+响应（Fluo-4，λx个2相=840 nm）至点捕获LTP协议（λu个2相=720纳米）。（F） LTP诱导后即刻（0分钟）、15分钟和25分钟（约9μm z堆栈平均值），未封端附近的星形细胞片段（如D；箭头）；PAP在15–25分钟时收缩（图S4C–S4E；视频S2）。（G） 在（D）和（E）（Glu，n=11）中所示的试验中，PAP心室颤动变化（%，平均值±SEM），且无MNI-谷氨酸盐（无Glu，n=11；箭头，无钙化开始）。（H） 总结：诱导后25分钟PAP心室颤动变化（%，平均值±SEM）（LTP，−13%±4%，∗∗∗p<0.005，n=16），不含MNI-谷氨酸（不含谷氨酸，1.3%±3.0%，n=9），远程ROI（如D；2.0%±3.5%，n=11），20μM布美他尼全细胞（−1.4%±3.3%，n=9）；∗p<0.05（df=15）；∗∗∗p<0.005（df=23）。
图5
图5
LTP诱导触发胶质谷氨酸转运体的退出，促进细胞外谷氨酸瞬态（A）用3D dSTORM定位的巴松管（红色簇）、Homer 1（绿色簇）和GLT1（品红色点）分子的突触周围模式；一个突触示例，显示了三个视角；x-y-z标尺，500 nm（STAR方法）。（B） 对照组织中GLT1和巴松管之间的最近邻距离（概率密度，平均值±SEM）以及cLTP诱导后约30分钟（图S5A和S5B；STAR方法）；样本大小：N个米，分子间距离；N个同步器，突触；N个之前，切片；SEM与N个之前 = 5;∗p<0.05（灰色段，差异显著）。（C） 图，通过生物素化和链霉亲和素（SA）附着（图S5D；STAR方法）在细胞外固定bFLIPE600n（所示为Venus和ECFP附着物）辐射状链球菌（图示为输送吸管）。（D） 实验设计：传感器注射吸管（场）记录Schaffer侧支刺激（stim）诱发的fEPSP，而bFLIPE600n信号在相邻ROI（矩形）内监测。（E） 例如，bFLIPE600n报告的谷氨酸信号（Δ对，ECFP/Venus信号比）响应Schaffer并行HFS（100 Hz，1s，红色箭头；10μM NBQX，50μM D-APV）in辐射状链球菌（也可参见图S5E和S5F）。（F） 对照组（绿色，n=8片）、LTP诱导期间（n=14，橙色）和存在50μM APV时（n=7，橙色空白）的相对fEPSP斜率（%，平均值±SEM）；∗∗∗p<0.005，诱导后20–25分钟的差异。（G） 在对照组（绿色）和LTP诱导后约25分钟（橙色），bFLIPE600n对配对脉冲（20 Hz，箭头；平均值±SEM）的反应。绘图、汇总（符号如F所示）；**p<0.01，LTP与对照或APV数据集之间的差异。
图6
图6
LTP诱导拓宽细胞外谷氨酸瞬变（A）树突状片段，CA1锥体细胞（AF 594通道）；红点、谷氨酸开斑；黄色箭头，iGluSnFR监测的行扫描位置（图S6A–S6C）。（B） 线扫描（如A；iGluSnFR通道）显示在点解封LTP诱导之前（顶部）和之后20-25分钟（底部），响应1ms解封脉冲的荧光瞬态（箭头，开始；红点，位置）；虚线，采样基线的时间窗口(F类0)和诱发的(F类)荧光轮廓，给出信号轮廓ΔF类 =F类−F类0（STAR方法）。（C） （B）中测试的iGluSnFR荧光曲线（点、像素值）；零位，无盖点位置；黑色和橙色线条，最适合高斯。（D） （A）-（C）中所示的试验总结：Δ中的相对变化（%，平均值±SEM）F类/F类0LTP诱导后约25分钟的半幅值信号全宽（FWHM）（LTP，9.0%±3.4%；n=12；∗p<0.03），星形胶质细胞内含有20μM布美他尼（LTP+bumetanide；−3.1%±3.0%；n=7；∗p<0.02，df=15；图S6D–S6G）；点，单独测试。（E） 图，用iGluSnFR急性切片监测Schaffer侧支束诱发的谷氨酸释放。图片：iGluSnFR荧光景观辐射状链球菌处于休息状态(F类0)在20 Hz的五次刺激期间(F类); 箭头，两个暂时的轴突隆起，假彩色。（F） 诱发的iGluSnFR信号景观（ΔF类 =F类−F类0; ROI（如E中所示）在LTP诱导前（0分钟，如E中）和诱导后30、55和90分钟（红色箭头；图S6H；STAR方法）；假颜色。（G） 相对fEPSP斜率（%，平均值±SEM，n=8片），方案如（E）和（F）所示；箭头，LTP诱导；∗∗∗p<0.001（相对于no-HFS对照，n=4；诱导后25-35分钟；df=10）。（H） 诱发iGluSnFRΔ的半高宽F类如图所示，LTP诱导后，相对于基线的信号在控制条件下超过5–35分钟（对照组，n=17磅），5–35 min（n=31磅），40–120 min（n=21磅）；点，单个波顿；棒材，平均值±SEM；∗∗∗p<0.005（df=46；4片）。（一） 在基线条件下（黑色）和阻断含有GluN2B的NMDAR（1μM Ro 25-6981，红色）后，以5 Hz的7个刺激诱发的CA1星形胶质细胞记录的fEPSP（a-fEPSP，电流钳，隔离NMDAR成分；3-5试验平均值）的上迹线；如图所示，对照细胞和一个用200μM肽S3透析的细胞；下部记录道，显示第7个a-fEPSP的碎片（矩形）（调整了脉冲前基线；扩展记录道见图S6I）。（J） I中所示的试验总结；纵坐标，a-fEPSP振幅减少Ro 25-698；点，单个细胞；棒材，平均值±SEM；∗p＜0.05（对照组n=7，S3组df=12）。
图7
图7
桶皮层的触须刺激LTP协议在体内通过刺激轴突触发星形胶质细胞侵袭的PAP心室颤动降低（A）转染小鼠腹后内侧核（VPM）3周后GCaMP6f的表达（STAR方法），冠状切片；LV，侧脑室；尾状壳核；宽视野图像，固定组织。（B） 复合事后图像，桶状皮层区域（冠状切片），星形胶质细胞表达GfaABC1D tdTomato（品红色；STAR方法），神经元结构表达GCaMPf6（绿色）；虚线矩形（插图，箭头）突出显示星形胶质细胞，轴突隆起出现在附近。（C） 实验图：使用两个fs激光器通过颅窗对大脑皮层（S1BF）进行2PE成像。LTP诱导方案在对侧使用RWS（5 Hz空气抽吸120 s）。（D） 通过颅骨窗（λx个2P（P）＝1040和910nm，单焦截面）。绿色（GCaMPf6），轴突信号响应RWS的热映射；洋红（td番茄），局部星胶质细胞；圆圈，靠近RWS响应的丘脑皮质轴突的PAP VF读出ROI示例（绿色；图S7A和S7B）。（E） 例如，S1BF（GCaMP6f，绿色）中的丘脑皮质轴突穿过星形胶质细胞区域（td番茄，品红色），带有对RWS测试（3 Hz，5 s）Ca反应的波顿2+立面图（中间面板）。（F） 钙的时间进程2+（E）所示的五个轴突隆起（绿色痕迹）处的信号（GCaMP6f）；黑线，平均值。（G） 在RWS LTP诱导方案（箭头，开始）期间，PAP心室颤动变化（%，平均值±SEM），对对侧RWS反应的近轴突隆起（橙色，n=5个细胞，3只动物），以及在同侧RWS期间（n=12个细胞，4只动物）。（H） （G）中的实验总结：RWS LTP方案开始后15–30分钟内PAP心室颤动变化（%，平均值±SEM）；点，来自单个单元格的数据；∗p<0.04（t检验，两个样本比较的df=15）。
图8
图8
LTP感应增强NMDAR介导的突触间串扰（A）插入图，测试NMDAR在两条传入通路（绿色和橙色闪电）之间介导的串扰的实验设计（Scimemi等人，2004）（图S8A；STAR方法）。绘图，相对EPSC振幅（平均值±SEM，n=13），单个刺激，间隔20秒，交替应用于两条路径（绿色和橙色）。记录AMPAR EPSC 12–15分钟（V米=−70毫伏；左纵坐标），然后NMDAR EPSC约5分钟（10μM NBQX，V米=−20毫伏；右纵坐标）。添加MK801后，NMDAR EPSC仅在活动（绿色）路径中记录。与基线（虚线）相比，在无声（橙色）通路中恢复刺激显示NMDAR EPSC振幅几乎没有变化。（B） 实验如（A）所示，但在激活途径中诱导LTP（红色箭头；n=7）。恢复刺激（箭头，串扰）后，静默（橙色）通路中NMDAR EPSC减少，表明谷氨酸从活跃（绿色）通路逃逸而激活NMDAR。（C） （A）和（B）中的实验总结。在NMDAR EPSC记录之前，对照组（Cntrl，n=13）中，LTP在一个（LTP-one，n=10）或两个（LTP both，n=11；图S8C和S8D）通路中诱导的串扰程度（由另一个通路的谷氨酸放电激活的单通路NMDAR的百分比；平均值±SEM）；∗第页<0.05（对于Cntrl和LTP-one，df=21），**第页<0.01（df=22），∗∗∗第页<0.005之间。（D） LTP诱导后PAP的拟议变化。在基线条件下（左），PAP限制谷氨酸对突触间隙和一些突触外NMDAR（红点）的作用。LTP诱导后（右），一些PAP退出，扩大了激活的突触外NMDAR的池，包括邻近的突触。（E） 图，LTP驱动PAP退出的候选细胞机制。LTP诱导激活突触后NMDAR并激活GLT1转运体。这会产生细胞外K+热点，激活NKCC1-cofilin-1途径，该途径以pH-敏感的方式参与负责形态发生的肌动蛋白聚合。
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