Promoterless, Nuclease-Free Genome Editing Confers a Growth Advantage for Corrected Hepatocytes in Mice With Methylmalonic Acidemia

doi:10.1002/hep.31570

.2021年6月；73(6):2223-2237.

doi:10.1002/hep.31570。 Epub 2021年5月21日。

无启动子、无核酸酶基因组编辑为甲基丙二酸血症小鼠校正肝细胞提供生长优势

附属公司

¹美国国立卫生研究院国家人类基因组研究所，马里兰州贝塞斯达。
²LogicBio Therapeutics，马萨诸塞州列克星敦。
^三马里兰州贝塞斯达NIH研究服务办公室。
⁴斯坦福大学儿科和遗传学系，加利福尼亚州斯坦福。
⁵以色列特拉维夫特拉维夫大学生物化学和分子生物学系。

^#贡献均等。

PMID： 32976669
预防性维修识别码： PMC8252383
内政部： 10.1002/庚.31570

无启动子、无核酸酶基因组编辑为甲基丙二酸血症小鼠校正肝细胞提供生长优势

兰迪·钱德勒等。肝病学. 2021年6月.

.2021年6月；73(6):2223-2237.

doi:10.1002/hep.31570。 Epub 2021年5月21日。

附属公司

¹美国国立卫生研究院国家人类基因组研究所，马里兰州贝塞斯达。
²LogicBio Therapeutics，马萨诸塞州列克星敦。
^三马里兰州贝塞斯达NIH研究服务办公室。
⁴斯坦福大学儿科和遗传学系，加利福尼亚州斯坦福。
⁵以色列特拉维夫特拉维夫大学生物化学和分子生物学系。

^#贡献均等。

PMID： 32976669
预防性维修识别码： PMC8252383
内政部： 10.1002年9月31570日

勘误表in

勘误表。
[未列出作者] [未列出作者] 肝病学。2022年11月；76(5):1551. doi:10.1002/hep.32763。Epub 2022年9月15日。肝病学。2022 PMID：36109864 免费PMC文章。没有可用的摘要。

摘要

背景和目标：腺相关病毒（AAV）基因治疗作为肝移植治疗代谢性疾病的替代疗法显示出巨大的前景，但仍受到转基因丢失和遗传毒性的限制。我们的研究旨在测试一种带有无启动子整合盒的AAV载体，该盒旨在提供持续的肝转基因表达，并与常规AAV治疗相比降低毒性。

方法和结果：我们设计的AAV载体将甲基丙二酰辅酶a变位酶（MMUT）转基因插入白蛋白基因座的3'端，并在甲基丙二酸血症（MMA）小鼠模型中进行测试。新生儿分娩后，我们纵向评估了肝脏转基因表达、血浆丙二酸甲酯水平、MMA生物标志物、成纤维细胞生长因子21（Fgf21）以及MMUT在白蛋白位点的整合。在尸检时，我们调查了所有接受治疗的MMA小鼠和对照鼠的同胞中是否存在AAV相关的肝细胞癌（HCC）。AAV介导的MMUT基因组编辑到白蛋白基因座导致MMA小鼠模型的永久性肝纠正，伴随着甲基丙二酸和Fgf21水平的降低，并提高了无HCC的生存率。随着时间的推移，转基因表达水平增加，甲基丙二酸甲酯逐渐减少，而MMA小鼠的白蛋白-MMUT整合和校正肝细胞数量增加，但在类似处理的野生型动物中没有增加。此外，MMUT在MMA环境中的表达赋予编辑细胞选择性生长优势，从而增强治疗反应。

结论：总之，我们的研究结果表明，AAV介导的、无启动子的、无核酸酶的白蛋白基因座基因组编辑在新生治疗的MMA小鼠中提供了安全和持久的治疗益处。

PubMed免责声明

数字

图1
在一项初步研究中，AAV‐Alb‐2A‐MMUT治疗可改善MMA小鼠的表型。（A） AAV‐Alb‐2A‐MMUT矢量整合和表达示意图。同源重组允许人类密码子优化的位点特异性基因添加*MMUT公司*在老鼠身上*阿尔布*终止密码子上游的位点。这会在本地人的控制下产生一个融合的等位基因*阿尔布*启动子产生融合mRNA。2A肽介导核糖体跳跃，产生两个独立的功能蛋白；Alb‐2A和MMUT。（B）生存曲线*嗯，但是^−/−*用8.6e处理的小鼠（n=4）¹¹AAVDJ‐Alb‐2A‐MMUT与未处理的VG嗯，但是^−/−小鼠（n=7**P（P）* < 0.02; log‐rank[Mantel‐Cox]测试）。（C）新生儿致死的血浆甲基丙二酸水平*嗯，但是^−/−*与未经治疗的历史小鼠相比，小鼠（n=3,3,2,2和2）没有显著减少*嗯，但是^−/−*动物（n=13、6、0、0和0）。（D）治疗组血浆甲基丙二酸水平*嗯，但是^–/–;玻璃钢^{INS‐MCK‐Mmut公司}*用8.6e治疗的小鼠（n=9、6和3）¹¹-2.5e¹²AAV8‐Alb‐2A‐MMUT的VG显著低于未处理的*嗯，但是^–/–;玻璃钢^{INS‐MCK‐Mmut公司}*小鼠（n=13、13和4**P（P）* < 0.05, ±). 误差线为±SEM。

图2
初步研究中AAV‐Alb‐2A‐MMUT转基因和MMUT表达的肝脏特征。（A） WT（+）、未经治疗的MCK MMA（−）和经治疗的MMA小鼠肝脏MMUT蛋白（85 kDa）表达的免疫印迹。肌动蛋白（42 kDa）用作负荷控制。（B）肝脏MMUT蛋白表达被量化为WT MMUT蛋白质表达的百分比，并归一化为肌动蛋白。注射后1个月和2个月安乐死小鼠的样品中MMUT表达相似，但在注射后13个月和15个月收集的样品中显著升高(**P（P）*<0.02，未配对t吨测试）。（C）肝病毒基因组数量(*MMUT公司*)相对于基因组鼠*Gapdh公司*治疗后第1、2和13至15个月的拷贝数（分别为3、3和5个月）**P（P）*<0.001，单向方差分析）。（D）百分比*阿尔布*包含*2A‐百万分之一*MMA小鼠在治疗后1至2个月（n=6）、13至15个月（n=5）或WT动物（n=5）在治疗后12至15个月中的整合(**P（P）*<0.03，单向方差分析）。

图3
肝脏mRNA表达*MMUT公司*在一项试点研究中。（A‐C）AAV‐Alb‐2A‐MMUT治疗小鼠的典型RISH图像。阳性细胞*MMUT公司*mRNA呈棕色。比例尺为2 mm，插件放大10倍。（A） A治疗2个月*嗯，但是^–/–;玻璃钢^{INS‐MCK‐Mmut公司}*小鼠肝脏。（B）治疗15个月*嗯，但是^–/–;玻璃钢^{INS‐MCK‐Mmut公司}*小鼠肝脏。（C） A治疗13个月*嗯^+/−*WT对照小鼠肝脏。（D）肝脏染色面积百分比*MMUT公司*治疗动物的mRNA；MMA小鼠在治疗后2个月（n=3）、13-15个月（n=5）或WT小鼠在治疗之后（n=5**P（P）*<0.005，单向方差分析）。所有误差条均为±SEM。

图4
AAV‐Alb‐2A‐MMUT纵向剂量研究*嗯，但是^–/–;玻璃钢^{INS‐MCK‐Mmut公司}*老鼠。（A）生存曲线*嗯，但是^–/–;玻璃钢^{INS‐MCK‐Mmut公司}*2.5e处理的小鼠¹²VG/pup（n=4）或2.5e¹¹AAVDJ‐Alb‐2A‐MMUT与未处理的VG/pup（n=18）*嗯，但是^–/–;玻璃钢^{INS‐MCK‐Mmut公司}*小鼠（n=42**P（P）* < 0.05). 2.5e处理的一些突变体¹¹每只幼崽在3个月（n=5）、6个月（n=5），8个月（n=1）和9个月（n=2）时处死VG，以进行终末分析。他们在安乐死当天的存活曲线中被审查。（B）血浆甲基丙二酸水平*嗯，但是^–/–;玻璃钢^{INS‐MCK‐Mmut公司}*2.5e处理的小鼠¹²VG/幼崽（n=4、3、0、2、2、2、2和2），含2.5e¹¹VG/处理过的幼犬（n=18、18、15、7、9、9、4和1）或未处理的*嗯，但是^–/–;玻璃钢^{INS‐MCK‐Mmut公司}*小鼠（n=5,11,10,5,7,5,7和7；*P（P）*<0.03和1、2、3、4、5、8和10个月，单向方差分析）。（C）的重量*嗯，但是^–/–;玻璃钢^{INS‐MCK‐Mmut公司}*2.5e处理的小鼠（MMA）¹²VG/幼犬（n=4、3、0、2、2、2,2和2），2.5e¹¹VG/幼犬（n=16、17、7、9、4、9、和1），或未经治疗（n=18、25、18、8、5、12、6和4**P（P）*<0.05，未配对t吨测试）。（D） WT（+）、未治疗MMA（−）、2.5e治疗MMA小鼠肝脏MMUT（85 kDa）和肌动蛋白（42 kDa¹¹第3、6、8、9和10个月时的VG/幼崽（m），或用2.5e处理¹²11个月龄时的VG/幼犬。（E） 2.5e肝MMUT蛋白定量¹¹VG/pup和2.5e¹²VG/幼鼠处理的MMA小鼠表达为MMUT WT表达的百分比，并归一化为肌动蛋白(**P（P）*<0.0001，未配对t吨测试和单向方差分析）。（F）与未经治疗的对照组相比，从6个月开始，两个治疗组的丙酸氧化都有所改善，但治疗小鼠的氧化从未达到WT水平。显示每个剂量的氧化测量值：2.5e¹²VG/pup（n=1、2和1）和2.5e¹¹（n=1、1、3、1、1、2、2和1）。阳性对照范围由5只受试WT小鼠确定，阴性对照范围由五只受试未经处理的MMA小鼠确定。

图5
纵向剂量研究中的血浆生物标志物*嗯^–/–;玻璃钢^{INS‐MCK‐Mmut公司}*老鼠。（A）与未经治疗的MMA小鼠相比，经治疗MMA小鼠Fgf21血浆水平的降低(*P（P）*<0.0001，未配对t吨测试）。误差线为±SEM。（B）百分比*阿尔布*包含*2A‐百万分之一*整合治疗MMA小鼠（n=5、5、4和2）和治疗WT小鼠（n=3、5、9和3）。（C）随着时间的推移，个体治疗小鼠的血浆2A蛋白水平增加。（D）线性回归分析显示血浆Alb‐2A水平与*Alb‐2A‐MMUT公司*集成(第页 ² = 0.99;*P（P）*<0.0001）和肝脏MMUT蛋白水平(第页 ²=0.66；*P（P）* = 0.0001).

图6
*MMUT公司*mRNA和MMUT蛋白在治疗小鼠肝脏中的表达。代表*MMUT公司*治疗小鼠连续肝脏切片的RISH和MMUT蛋白免疫组化染色。mRNA或蛋白表达阳性的细胞被染成棕色。比例尺为1 mm，插件放大10倍。（A） A类*嗯，但是^–/–;玻璃钢^{INS‐MCK‐Mmut公司}*小鼠治疗后3个月（2.5e¹¹VG）。（B） A类*嗯，但是^–/–;玻璃钢^{INS‐MCK‐Mmut公司}*小鼠治疗后9个月（2.5e¹¹VG）。（C） A类*嗯，但是^–/–;玻璃钢^{INS‐MCK‐Mmut公司}*小鼠治疗10个月后（2.5e¹¹VG）。（D） A类*嗯，但是^–/–;玻璃钢^{INS‐MCK‐Mmut公司}*小鼠治疗后11个月（2.5e¹²VG）。（E） A类*嗯，但是^+/——;玻璃钢^{INS‐MCK‐Mmut公司}*（WT表型，2.5e¹²VG）小鼠治疗后11个月。

图7
AAV治疗后未发现HCC迹象。H&E和*MMUT公司*治疗小鼠连续肝脏切片的RISH染色。（A）一个*嗯，但是^–/–*小鼠治疗后13个月（8.58e¹¹VG）。几乎没有的区域*MMUT公司*RNA染色显示MMA肝细胞表型正常；无HCC迹象。两幅图像均以40×比例尺拍摄，均为20µm。（B） A类*嗯，但是^–/–;玻璃钢^{INS‐MCK‐Mmut公司}*小鼠治疗后15个月（1.9e¹²VG）。具有重要意义的区域*MMUT公司*RNA染色显示正常的显微镜外观。两幅图像均以40×比例尺拍摄，均为20µm。（C） A类*嗯^–/–;玻璃钢^{INS‐MCK‐Mmut公司}*小鼠治疗后15个月（8.58e¹¹VG）。校正和未校正肝细胞边界区域再次显示MMA或健康组织的正常肝细胞表型。在这些边界，没有HCC的迹象。两幅图像均以10倍的比例尺拍摄，比例尺为100µm。（D）（C）的放大倍数。两幅图像均以40×比例尺拍摄，均为20µm。（E） AAV‐Alb‐2A‐MMUT治疗的WT和MMA小鼠与历史HCC样本的HCC发病率。⁽ ⁹ ⁾缩写：CBA，鸡β肌动蛋白；绿色荧光蛋白；TBG，甲状腺素结合球蛋白。

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1. Pasi KJ、Rangarajan S、Mitchell N、Lester W、Symington E、Madan B等。AAV5‐hFVIII‐SQ基因治疗血友病的多年随访A.N Engl J Med 2020；382:29‐40.-公共医学
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1. Nathwani AC、Tuddenham EG、Rangarajan S、Rosales C、McIntosh J、Linch DC等。腺病毒相关病毒载体介导的血友病基因转移B.N英国医学杂志2011；365:2357‐2365.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Nakai H、Yant SR、Storm TA、Fuess S、Meuse L、Kay MA。染色体外重组腺相关病毒载体基因组主要负责体内稳定的肝脏转导。《病毒杂志》2001年；75:6969‐6976.-项目管理咨询公司-公共医学

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[2] Baruteau J、Waddington SN、Alexander IE、Gissen P.单基因肝病的基因治疗：临床成功、当前挑战和未来展望。J Inherit Metab Dis 2017；40:497‐517.-项目管理咨询公司-公共医学

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[4] Pasi KJ、Rangarajan S、Mitchell N、Lester W、Symington E、Madan B等。AAV5‐hFVIII‐SQ基因治疗血友病的多年随访A.N Engl J Med 2020；382:29‐40.-公共医学

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[6] Nienhuis AW、Nathwani AC、Davidoff AM。血友病的基因治疗。Mol Ther 2017；25:1163‐1167.-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Nathwani AC、Tuddenham EG、Rangarajan S、Rosales C、McIntosh J、Linch DC等。腺病毒相关病毒载体介导的血友病基因转移B.N英国医学杂志2011；365:2357‐2365.-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Nathwani AC、Tuddenham EG、Rangarajan S、Rosales C、McIntosh J、Linch DC等。腺病毒相关病毒载体介导的血友病基因转移B.N英国医学杂志2011；365:2357‐2365.-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Nakai H、Yant SR、Storm TA、Fuess S、Meuse L、Kay MA。染色体外重组腺相关病毒载体基因组主要负责体内稳定的肝脏转导。《病毒杂志》2001年；75:6969‐6976.-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Nakai H、Yant SR、Storm TA、Fuess S、Meuse L、Kay MA。染色体外重组腺相关病毒载体基因组主要负责体内稳定的肝脏转导。《病毒杂志》2001年；75:6969‐6976.-项目管理咨询公司-公共医学

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