Increased Efficacy of Histone Methyltransferase G9a Inhibitors Against MYCN-Amplified Neuroblastoma

doi:10.3389/fonc.2020.00818

.2020年5月27日10:818。

doi:10.3389/fonc.2020.00818。 eCollection 2020。

组蛋白甲基转移酶G9a抑制剂对MYCN公司-扩增神经母细胞瘤

雅各布·贝拉米¹, 玛丽安娜·塞梅斯¹, 桑博尔·梅勒^1 2, 安东尼·达洛索², 马杜·科拉雷迪¹, 丹尼尔·卡奇普尔^三, 卡里姆·马利克¹

附属公司

¹英国布里斯托尔大学细胞与分子医学院癌症表观遗传学实验室。
²英国布里斯托尔Southmead医院细胞病理科。
^三澳大利亚新南威尔士州韦斯特米德儿童医院儿童研究所。

PMID： 32537432
预防性维修识别码： PMC7269128
内政部： 10.3389/fonc.2020.00818

组蛋白甲基转移酶G9a抑制剂对MYCN公司-扩增神经母细胞瘤

雅各布·贝拉米等。前Oncol. 2020.

.2020年5月27:10:818。

doi:10.3389/fonc.2020.00818。 eCollection 2020。

作者

雅各布·贝拉米¹, 玛丽安娜·斯泽姆斯¹, 桑博尔·梅勒^1 2, 安东尼·达洛索², 马杜·科拉雷迪¹, 丹尼尔·卡奇普尔^三, 卡里姆·马利克¹

附属公司

¹英国布里斯托尔大学细胞和分子医学院癌症表观遗传学实验室。
²英国布里斯托尔Southmead医院细胞病理科。
^三澳大利亚新南威尔士州韦斯特米德儿童医院儿童研究所。

PMID： 32537432
预防性维修识别码： PMC7269128
内政部： 10.3389/fonc.2020.00818

摘要

靶向抑制蛋白质调节表观遗传变化是癌症治疗中越来越重要的优先事项，目前正在开发许多小分子抑制剂。对于神经母细胞瘤（NB），一种缺乏基因内突变的儿童实体瘤，表观遗传解除调控可能特别重要。在本研究中，我们验证了组蛋白甲基转移酶G9a/EHMT2与NB预后不良的指标相关。G9a蛋白的免疫学分析表明其在NB细胞系中更高表达MYCN公司扩增是NB患者预后不佳的主要决定因素。此外，原发性肿瘤中的G9a蛋白在低分化/未分化NB中以较高水平表达，并与高EZH2表达相关，EZH2是NB中已知的合作癌蛋白。我们的功能分析表明，siRNA-介导的G9a缺失抑制所有NB细胞系中的细胞生长，但引人注目的是，仅在具有以下特征的NB细胞中触发凋亡MYCN公司扩增，表明G9a和MYCN之间存在合成致死关系。当使用G9a、UNC0638和UNC0642小分子抑制剂时，这种敏感性模式也很明显。在带有四调节MYCN的SHEP-21N等基因模型中，也证明了G9a抑制在MYCN-过度表达的情况下的增强效果。最后，通过RNA测序，我们确定了几个潜在的肿瘤抑制基因，这些基因在NB中被G9a抑制重新激活，包括CLU、FLCN、AMHR2、和AKR1C1-3型总之，我们的研究强调了G9a在NB中的低估作用，尤其是在MYCN公司-肿瘤放大。

关键词：G9a抑制剂；MYCN；细胞凋亡；表观遗传治疗；神经母细胞瘤。

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数字

图1
G9a mRNA和蛋白表达与预后不良和*MYCN公司*放大。**（A）**Kaplan–Meier分析表明，G9a的高表达与原发性NB预后不良相关（SEQC，GSE62564）。Bonferroni-修正第页-给出了对数秩检验的值。**（B）**与非MNA相比，MNA神经母细胞瘤中G9a mRNA的表达显著升高。这个第页-数值通过单向方差分析计算。**（C）**G9a蛋白在一组细胞中表达的免疫印迹*MYCN公司*-扩增和非扩增NB细胞系。β-肌动蛋白用作加载控制。的代表n个= 3.（D）相对G9a蛋白的散点图是通过对**（C）**当归一化为β-肌动蛋白时，G9a蛋白在MNA神经母细胞瘤中的表达较高。通过非配对T检验测量显著性(*第页< 0.05).

图2
原发性NBs中G9a和EZH2的免疫组织化学检测。**（A）**神经母细胞瘤的苏木精和曙红染色、G9a和EZH2免疫组织化学。（GN，神经节细胞瘤；DIFF NB，分化神经母细胞瘤；PD NB，低分化NB；UD NB（未分化NB）；MNA，*MYCN公司*放大）。**（B）**G9a阳性染色与神经母细胞瘤的INPC分化状态相关。**（C）**根据阳性细胞的比例（0，无染色；1，单个细胞零星染色；2，染色细胞<20%；3，染色细胞20-80%；4，染色细胞>80%）对免疫阳性进行评分。神经母细胞瘤中G9a和EZH2阳性细胞的比例密切相关。

图3
G9a缺失后的凋亡细胞死亡依赖于MYCN。**（A）**收获来自MNA细胞系的漂浮细胞和粘附细胞，并在G9a耗竭后通过台盼蓝包涵体测定进行计数。每个细胞系的左图显示G9a耗尽和阴性对照之间的死亡细胞百分比。右侧的图表显示了采集的细胞的活细胞计数，该计数用作细胞生长的代理。星号表示重大变化(*第页< 0.05, ***第页<0.01，ns，不显著，n个= 3). 误差条显示SEM。对于每个细胞系，显示有效消耗、凋亡和自噬标记的免疫印迹如下所示。β-肌动蛋白用作负荷控制。这些斑点代表了n个= 3.（B）非MNA细胞系中的活细胞和死细胞计数及Western blots。

图4
G9a缺失仅导致MYCN诱导的S21N细胞死亡。**（A）**如前所述，在G9a缺失后，通过台盼蓝包合试验从S21N细胞中采集漂浮细胞和粘附细胞，包括MYCN诱导细胞和未诱导细胞。**（B）**G9a、凋亡和自噬标记物的免疫印迹。(*第页< 0.05, ***第页<0.01，ns，不显著，n个= 3).

图5
神经母细胞瘤细胞系对G9a抑制剂UNC0638和UNC0642的敏感性。**（A）**13个神经母细胞瘤细胞系，包括6个*MYCN公司*-放大（红线阴影），七个非-*MYCN公司*-72小时后，通过基于MTT的细胞增殖试验筛选扩增的（黑线阴影）和两个非癌细胞系（绿线阴影），以确定对G9a SMI UNC0638的敏感性。将0.0μM绘制为0.1μM，以便在对数刻度上绘制图表。误差条显示SEM。n个≥ 3.（B）使用G9a SMI UNC0642对13个NB和两个正常细胞系进行MTT分析。**（C）**IC条形图₅₀所有细胞系的UNC0638值。误差条显示SEM。**（D）**IC条形图₅₀带UNC0642的值。误差条显示SEM。**（E）**基于MTT分析的IC₅₀UNC0638的值来自**（A）**显示为MNA和非MNA细胞系之间的散点图。误差条显示SEM***第页<0.01，未配对t检验。**（F）**-基于MTT分析的IC₅₀UNC0642的值来自**（B）**显示为MNA和非MNA细胞系之间的散点图。误差条显示SEM***第页<0.01，未配对t吨-测试。**（G）**72小时后，通过MTT细胞增殖试验筛选有和没有诱导MYCN的S21N细胞系，以确定其对G9a抑制剂UNC0638的敏感性。将0.0μM绘制为0.1μM，以对数刻度绘制图表。误差条显示SEM。N个= 3.（H）使用UNC0642对诱导和未诱导S21N细胞进行MTT分析。**（一）**-S21N IC条形图₅₀有归纳法和无归纳法的值。误差条显示SEM***第页<0.01，未配对t吨-测试。

图6
UNC0638特异性诱导MNA神经母细胞瘤细胞系凋亡。**（A）**在5–10μM UNC0638处理72小时后，从MNA细胞系中采集漂浮细胞和粘附细胞，并通过台盼蓝包合试验进行计数。每个细胞系的左侧图显示死亡细胞的百分比，而右侧图显示活细胞计数，用作细胞生长的代理。星号表示重大变化(***第页< 0.01,n个= 3). 误差条显示SEM。每个细胞系的蛋白质印迹显示细胞死亡标记、自噬标记和MYCN。β-肌动蛋白用作负荷控制（代表n个= 3).（B）用10μM UNC0638处理72 h后非MNA细胞的活细胞和死细胞计数及Western blot(*第页<0.05，ns不显著，n个= 3).

图7
UNC0638导致MYCN过度表达S21N细胞凋亡。**（A）**在72小时5μM UNC0638处理后，从含有和不含诱导MYCN的S21N细胞中采集漂浮细胞和粘附细胞，并通过台盼蓝包合试验进行计数。图表显示了处理与对照之间的死亡和活细胞百分比。误差线为SEM(*第页<0.05，ns不显著，n个= 3).（B）用5μM UNC0638处理诱导和未诱导S21N细胞72小时的Western blot。

图8
BIX-01294处理的LAN-1细胞的RNA序列确定G9a调节基因。**（A）**3μM BIX-01294对LAN-1 NB细胞进行72小时生物复制处理的差异表达基因（DEG）热图(第页<0.005，最小折叠变化1.3）。**（B）**基因集富集分析（GSEA）显示MYC/MYCN驱动的转录组变化的逆转。MYCN-157基因集源自Valentijn等人（34）。**（C）**GSEA表明凋亡相关基因集上调**（D）**EZH2、HDAC1和HDAC3抑制。**（E）**Kaplan–Meier生存分析表明，在498例原发性NB肿瘤（SEQC，GSE62564）的表达数据集中，LAN-1中BIX-01294治疗上调的基因的高表达与良好的预后相关，而**（F）**BIX-01294下调基因的高表达与预后不良相关。**（G）**用G9a抑制剂（5–10μM UNC0638，24 h）处理后，在MNA NB细胞系、LAN1和Kelly以及非MNA细胞GI-M-EN和SK-N-AS中验证DEG。

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