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.2020年6月12日；20(1):39-52.
doi:10.3727/105221620X15874935364268。 Epub 2020年4月21日。

ARF/INK4A缺失促进肝前体细胞向肿瘤转化支持其在肝癌发生中的作用

罗宾·施特劳斯 1, 凯瑟琳·M·奥兹利 1, 亚当·帕斯曼 1, 乔安娜·范·武伦 2, 梅根·L·芬奇-埃德蒙森 1, 伯纳德A Callus 1, 乔治·杨致远 1
附属公司

ARF/INK4A缺失促进肝前体细胞向肿瘤转化支持其在肝癌发生中的作用

罗宾·施特劳斯等。 基因表达. .

摘要

肝前体细胞（LPC）在慢性损伤期间有助于肝脏再生，并被认为是肝癌（包括肝细胞癌）的起源细胞。这个CDKN2A型编码肿瘤抑制因子交替阅读框蛋白（ARF）和INK4A的基因座被确定为肝癌中最常见的改变基因之一。本研究表明CDKN2A型增强LPCs的致瘤转化。ARF和INK4A的表达水平是在一组转化和未转化的野生型LPC株系中测定的。此外，失活LPC的转化潜能CDKN2A型在来源于阿尔夫-/-和CDKN2A型飞行/飞行CRISPR-Cas9抑制小鼠和野生型LPCCDKN2A型.ARF和INK4A丰度在LPC转化后持续减少或消融。阿尔夫-/-和CDKN2A型-/-LPC表现出了转变的特征，例如与未改变的对照LPC品系相比，独立于锚定物且生长更快CDKN2A型.转型不是立即的，这表明CDKN2A型光靠自己是不够的。进一步的分析显示，p21的表达降低，上皮标记物减少，间充质标记物增加，表明上皮细胞向间充质细胞转化，在细胞失活后CDKN2A型基因是致瘤转化所必需的。ARF和INK4A的缺失增强了LPC进行致瘤转化的倾向。由于LPC代表癌干细胞候选人CDKN2A型作为LPC转化的驱动因素，ARF和INK4A被认为是肝癌可行的预后标志物和治疗靶点。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
INK4A在转化的肝祖细胞（LPC）中经常下调。（A） 非转化（NT）BMOL1和从其衍生的三个转化细胞系（TA类，T型B类、和TC类)在半固体琼脂中培养非转化（NT）和转化（T）、BMOL-TAT NT和T、BMOL3、BMEL-AEGFP和BMEL-TAT细胞系。14天后用解剖显微镜记录数字图像。比例尺：1 mm。（B）Cdkn2a公司编码两种蛋白质的位点，交替阅读框蛋白（ARF）（红色）和INK4A（蓝色）。尽管这些蛋白质共享外显子2和3，但它们有不同的第一外显子、外显子1β和1α，以及交替的阅读框架。（C） 从NT和T BMOL1、BMOL2、BMOL-TAT、BMOL3、BMEL-AEGFP（BMEL-A）和BMEL-TAT细胞系制备蛋白裂解物。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离裂解产物，并对ARF、INK4A和β-肌动蛋白进行免疫印迹。尺寸标记以kDa为单位。（D） 从同一株系中提取的总RNA合成cDNA，并用作聚合酶链反应（PCR）的模板来扩增阿尔夫,墨水4a、和Gapdh公司扩增子（分别为146、185和437 bp）通过琼脂糖凝胶电泳分离。（E） 基因组DNA被分离出来并用作模板来扩增外显子（Ex）1β,1α、和Gapdh公司产品（174、162和437 bp）在琼脂糖凝胶上分离。
图2
图2
BMEL公司-阿尔夫 −/−不表达ARF或INK4A的LPC在培养中转化。（A） 从未转化的BMEL-AEGFP（BMEL）和BMEL中提取基因组DNA-阿尔夫 −/−LPC线路(阿尔夫 −/−)1、2和3，并使用特异于外显子1β和1α的引物进行PCR扩增Cdkn2a公司、和Gapdh公司（B）从BMEL制备蛋白裂解物-阿尔夫 −/−第13代细胞（p13）（低）或p57或更高（高）。用SDS-PAGE分离细胞裂解产物，转移到膜上，并对ARF、INK4A和β-肌动蛋白进行免疫印迹。（C） BMEL公司-阿尔夫 −/−用4μM 5-氮杂胞苷（5-aza）、4 mM丁酸钠（Na-But）或0.1%二甲基亚砜（DMSO）载体对照物处理1个细胞72小时。制备蛋白裂解物并进行免疫印迹，如（B）所述。将未转化的BMEL和BMOL1细胞作为阳性对照。尺寸标记以kDa表示。（D） BMEL的增长-阿尔夫 −/−每四至五代用半固体琼脂评估品系。14天后用解剖显微镜记录数字图像。比例尺：1毫米。如图所示，显示了通道编号（p）的图像。（E） 非转化（NT）、NT低代（NT）细胞加倍时间L（左）)，NT高通道（NTH（H）)和转化（T）BMEL-阿尔夫 −/−使用Cellavista分析仪测定LPC谱线，并绘制为平均值±平均值标准误差（SEM）(n个 = 3). 统计显著性由学生的t吨-测试*第页 < 0.05, **第页 < 0.01.
图3
图3
CRISPR-Cas9-介导Cdkn2a公司删除增强了LPC转换。（A） 用含有特异性导向序列的CRISPR-Cas9质粒转染未转化的BMOL1细胞Cdkn2a公司外显子2，选择，单细胞克隆。（B） 用SDS-PAGE分离每个导向序列的三个克隆和亲本细胞的裂解液，转移到膜上，并对ARF、INK4A和β-actin进行免疫印迹。尺寸标记以kDa为单位。（C） 对克隆进行测序，并列出已鉴定的突变。（D） 使用Cellavista分析仪测定增殖率。加倍时间绘制为平均值±SEM(n个 = 3） 对于每个细胞系。统计显著性由学生的t吨-测试*第页 < 0.05, **第页 < 0.01. （E） 克隆和亲本细胞在半固体琼脂中培养2周，然后用解剖显微镜成像。比例尺：1 mm。
图4
图4
有条件损失Cdkn2a公司增强LPC转换。（A） LoxP站点侧翼Cdkn2a公司外显子2和3Cdkn2a公司 飞行/飞行小鼠，导致Cre重组酶（Cre）诱导后外显子2和3缺失。设计引物扩增外显子2和3缺失后的产物（Δ外显子2,3，绿色箭头）。（B） 有条件的Cdkn2a型淘汰赛BMEL-Cdkn2a公司 飞行/飞行LPC线路(Cdkn2a公司 飞行/飞行)感染了携带GFP或Cre重组酶结构的慢病毒。对从亲本（P）和感染细胞系中提取的基因组DNA进行外显子1β、1α、2和Δ外显子2、3的PCR。扩增子通过琼脂糖凝胶电泳分离。（C） 用SDS-PAGE分离蛋白裂解产物，并对ARF、INK4A和β-肌动蛋白进行免疫印迹。尺寸标记以kDa表示。所示的斑点和凝胶图像代表了n个 = 3个实验。（D） 亲代（P）、GFP-和C感染BMEL的细胞倍增时间-Cdkn2a公司 飞行/飞行使用Cellavista分析仪测定LPC和BMEL-AEGFP细胞，并绘制为平均值±SEM(n个 = 3). 统计显著性由学生的t吨-测试(***第页 < 0.001). （E） 感染细胞系和亲代（P）细胞系分别对A、B和C进行10、10和7次传代，并在半固体琼脂中生长。14天后记录图像。比例尺：1 mm。
图5
图5
p21和p53在转化过程中丰度降低阿尔夫 −/−LPC。（A） 由非转化（NT）和转化（T）BMEL制备的蛋白裂解物-阿尔夫 −/−LPC线路(阿尔夫 −/−)通过SDS-PAGE分离，并对p53、p21和β-actin进行免疫印迹。尺寸标记以kDa为单位。p53（B）和p21（C）相对于β-肌动蛋白的平均±SEM带强度显示为BMEL标准化-阿尔夫 −/−1个NT(n个 = 3). 统计显著性由学生的t吨-测试*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001.
图6
图6
阿尔夫 −/−野生型BMOL1 LPC在转化的同时发生上皮-间质样转变。（A） 非转化（NT）和转化（T）BMEL-阿尔夫 −/−LPC线路(阿尔夫 −/−)包括低（NTL（左）)和高（NTH（H）)通道NT BMEL-阿尔夫 −/−对Cs进行波形蛋白（Vim）染色，并用DAPI进行复染。比例尺：50μm。蜗牛1（B） 和Zeb1号机组（C） 与管家相关的成绩单丰度塔夫4a使用定量PCR（qPCR）进行测量，并绘制为平均值±SEM(n个 = 3). 统计显著性由Student’st吨-测试*第页 < 0.05. （D） BMEL裂解液-阿尔夫 −/−通过SDS-PAGE分离LPC株，并对E-cadherin（E-cad）、EpCAM、SNAIL、SLUG和β-actin进行免疫印迹。蛋白质印迹一式两份。尺寸标记以kDa表示。（E） NT和TA类，T型B类，和TC类如（A）所述，对BMOL1细胞进行波形蛋白免疫荧光染色。（F） 裂解物由NT和T制备A类，T型B类、和TC类BMOL1细胞和E-cadherin、EpCAM、SLUG和β-actin免疫印迹，如（D）所述。
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引用人

  • 新老肝癌关键参与者。
    CuestaáM、Palao N、Bragado P、Gutierrez-Uzquisa A、Herrera B、Sánchez A、Porras A。 CuestaáM等人。 国际分子科学杂志。2023年12月5日；24(24):17152. doi:10.3390/ijms242417152。 国际分子科学杂志。2023 PMID：38138981 免费PMC文章。 审查。

工具书类

    1. Ferlay J、Soerjomataram I、Dikshit R、Eser S、Mathers C、Rebelo M、Parkin DM、Forman D、Bray F。全球癌症发病率和死亡率：2012年全球癌症的来源、方法和主要模式。国际癌症杂志2015；136（5）：E359–386。-公共医学
    1. Marquardt JU、Andersen JB、Thorgeirsson SS。肝癌细胞起源的功能和遗传解构。Nat Rev Cancer 2015年；15(11):653–667.-公共医学
    1. Schulze K、Imbeaud S、Letouze E、Alexandrov LB、Calderaro J、Rebouissou S、Couchy G、Meiller C、Shinde J、Soysouvanh F等。肝细胞癌的外显子序列确定了新的突变特征和潜在的治疗靶点。自然遗传学。2015;47:505–11.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Anzola M、Cuevas N、Lopez-Martinez M、Martinez de Pancorbo M、Burgos JJ。P16ink4a基因的改变并不是肝癌患者接受治疗性肝切除术后生存的预后指标。胃肠病学肝病杂志。2004;19(4):397–405.-公共医学
    1. 癌症基因组图谱研究网络。肝细胞癌的全面和综合基因组特征。2017年单元格；169(7):1327–41. e1323。-项目管理咨询公司-公共医学

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