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.2020年4月7日6:20。
doi:10.1038/s41421-020-0159-x。 eCollection 2020。

激素和化学物质促进胰岛簇体外扩增

林静玉 # 1, 杰成 # 1, 亚钦杜 # 2, 韦潘（Wei Pan） # 1, 张忠 三, 金旺（Jin Wang） 4, 杰安 4, 范扬 4, 徐云飞 5, 慧琳 1, 文韬安 1, 贾旺 6, 赵阳 6, 仁杰柴 三, 雪英莎 2, 胡慧丽 7, 金鹏孙 2 6, 小雨 1
附属公司

激素和化学物质促进胰岛簇体外扩增

林靖宇等。 细胞发现. .

摘要

组织再生，例如体外胰岛组织增殖，可以作为糖尿病治疗和个性化药物测试的一种有希望的策略。然而，这种战略尚未实现。繁殖可分为两个步骤，体外扩增和重复传代。迄今为止，即使是体外胰岛扩增的第一步也没有实现。在这里，我们描述了一种方法，该方法通过结合特定再生因子和体外化学化合物，使从怀孕小鼠或野生型大鼠分离的胰岛簇得以扩展。扩张的胰岛簇表达胰岛素、胰高血糖素和生长抑素，它们分别是对应于胰腺β细胞、α细胞和δ细胞的标记物。这些不同类型的细胞聚集在一起，在空间上组织和功能与原代胰岛相似。进一步的机理分析表明，我们配方中的福斯克林有助于更新和再生，而埃森丁-4对保持胰岛细胞特性至关重要。我们的研究结果为胰岛簇的体外扩增提供了一种新的方法，这是开发用于胰岛组织体外增殖的未来方案和培养基的重要一步。这种方法对于未来再生糖尿病治疗和使用来自同一个人的大量胰岛的个性化药物非常重要。

关键词：细胞生物学；发育生物学；干细胞。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突作者声明他们没有利益冲突。

数字

图1
图1。用于胰岛扩张的培养基配方开发流程图。
先前研究中用于干细胞扩增、分化和胰岛细胞转化的化学物质和激素（上表）根据其与细胞分裂和增殖、胰岛特性以及细胞更新和再生相关的功能进行分类（中表）。总结并组合了用于体外胰岛群扩张的培养基配方的常见因素。
图2
图2。怀孕小鼠胰岛簇的体外扩增。
一单个胰岛细胞或胰岛簇的代表性图像（约6000–9000µm2原始表面积）。实验是在怀孕的小鼠上进行的。单细胞图像中的比例尺代表50µm，而集群图像中的一个比例尺则代表100µm。b条PIEM三维培养后不同时间分散的野生型小鼠胰岛单个细胞或簇的代表性图像。单细胞图像中的比例尺代表50µm，而集群图像中的一个比例尺则代表100µm。c（c）每100个胰岛细胞簇中的扩展簇数。实验一式三份，并用怀孕的小鼠进行。数据表示为平均值±SEM。d日每100个胰岛细胞簇中的扩展簇数。在野生型小鼠上进行了三次实验。数据表示为平均值±SEM。电子妊娠小鼠胰岛簇与分离的原代小鼠胰岛中胰岛细胞识别标记物表达的比较*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001；将集群与小鼠原代胰岛进行比较。数据显示为至少三个独立实验的平均值±SEM。使用未配对双尾Student’s分析数据t吨-测试。
图3
图3。胰岛细胞标记物免疫染色和体外扩增胰岛簇的功能检查。
一妊娠小鼠扩张胰岛簇中胰岛素和胰高血糖素的免疫荧光染色；比例尺代表50μm。b条妊娠小鼠扩张胰岛簇中胰岛素和生长抑素的免疫荧光染色；比例尺代表50μm。c（c）扩张胰岛簇的细胞组成。误差条表示平均值±SD(n个 = 3).d日妊娠小鼠扩张胰岛簇中胰岛素和PDX1的免疫荧光染色；比例尺代表50μm。电子妊娠小鼠扩张胰岛簇胰岛素和MAFA的免疫荧光染色；比例尺表示50μm。（f）妊娠小鼠扩张胰岛簇中胰岛素和NKX6.1的免疫荧光染色；比例尺代表50μm。克测量用20 mM葡萄糖和100 nM GLP-1处理的原代胰岛或扩张胰岛簇的胰岛素分泌30分钟。对照组用2.8 mM葡萄糖处理***P（P） < 0.001，将刺激组与对照组进行比较。###P（P） < 0.001，将扩张的胰岛簇与原代胰岛进行比较。小时用20 mM葡萄糖和100 nM UCN3处理原代胰岛和扩张胰岛簇1小时后，测量其生长抑素分泌。对照组用1 mM葡萄糖处理**P（P） < 0.01，刺激组与对照组比较。NS，无显著性，扩张的胰岛簇与原代胰岛相比较。我用25 mM精氨酸处理原代胰岛和扩张胰岛簇1小时后，测量其胰高血糖素分泌。对照组用5 mM精胺酸处理***P（P） < 0.001，刺激组与对照组进行比较。NS无显著性，扩张的胰岛簇与原代胰岛比较。数据显示为至少三个独立实验的平均值±SEM。使用未配对双尾Student’s分析数据t吨-测试。
图4
图4。大鼠胰岛簇的体外扩增。
一大鼠胰岛单细胞或簇的代表性图像（约5000–8000µm2原始表面积）。单细胞图像中的比例尺代表50µm，而集群图像中的一个比例尺则代表82.5µm。b条每100个胰岛细胞簇中的扩展簇数。实验在大鼠身上进行，一式三份。数据显示为平均值±SEM。c（c）与原代胰岛相比，大鼠扩张群中胰岛细胞识别标记物的表达比较*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01；集群与原代大鼠胰岛进行比较。数据显示为至少三个独立实验的平均值±SEM。使用未配对双尾Student’s分析数据t吨-测试。
图5
图5。与原代胰岛相比，扩增簇中基因表达的qRT-PCR分析。
一妊娠小鼠扩增群与分离原代胰岛增殖和细胞周期标记物表达的比较。b条妊娠小鼠多能性和再生标记物表达的比较——扩增的集群与分离的原代胰岛。c（c）妊娠小鼠扩增簇与分离原代胰岛中胰岛和胰腺祖细胞标志物表达的比较。d日大鼠扩张群与孤立原代胰岛增殖和细胞周期标记物表达的比较。电子大鼠扩大集群与孤立原代胰岛中多能性和再生标记物表达的比较。（f）大鼠扩大群与孤立原代胰岛中胰岛和胰腺祖细胞标记物表达的比较*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001; 将集群与原代胰岛进行比较。数据显示为至少三个独立实验的平均值±SEM。使用未配对双尾Student’s分析数据t吨-测试。
图6
图6。FSK和exendin-4在体外胰岛扩张中的重要作用。
a-d公司胰岛细胞标志物表达的qRT-PCR分析(一)，增殖和细胞周期标志物(b条)、多能性和再生标记(c（c）)胰岛和胰腺祖细胞标记物(d日)在怀孕的小鼠中，用PIEM或不含FSK或exendin-4的PIEM培养3天后，扩大集群*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001; 将不含FSK或exendin-4的PIEM培养的细胞团与完全PIEM中培养的细胞进行比较。数据显示为至少三个独立实验的平均值±SEM。使用未配对双尾Student’s分析数据t吨-测试。
图7
图7。当前方法和未来方向的图表。
原代胰岛细胞簇的分离、接种和扩增示意图。从怀孕小鼠或野生型大鼠分离胰岛后，通过与Dispase II孵育将胰岛消化成适当的细胞簇。优化了消化时间，并使用机械吹气力生成簇。这些细胞簇在PIEM中进行三维培养，以实现胰岛细胞簇的体外扩增。
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