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.2019年9月25日；9(1):13810.
doi:10.1038/s41598-019-50226-9。

L型电压门控钙通道对体外人皮层神经元网络的调节

威廉·普朗布利 1, 尼克·布兰登 2, 塔里克·Z·迪布 3, 杰里米·哈尔 1, 阿德里安·哈伍德 4
附属公司

L型电压门控钙通道对体外人皮层神经元网络的调节

威廉·普朗布利等。 科学代表. .

摘要

体外多电极阵列（MEA）和干细胞的神经元分化的结合提供了从患者或工程人类细胞系研究人类神经元网络的能力。在这里，我们使用基于MEA的分析来探索hiPSC衍生神经元的突触功能和网络相互作用。神经网络行为首先出现在大约30天的培养中，由谷氨酸神经传递驱动。在接下来的30天里，抑制性GABA能信号将网络行为塑造成突发放电活动和低活动期的同步规律模式。L型电压门控钙通道亚单位基因突变与精神分裂症和双相情感障碍的发生密切相关。我们发现，尽管基本神经元放电率不受影响，但L型电压门控钙通道抑制剂对hiPSC衍生神经网络的同步放电模式具有剂量依赖性影响。这表明，MEA分析具有足够的敏感性，可以检测可能由精神病风险基因功能减退引起的神经元相互作用模式的变化。我们的研究强调了基于体外MEA的平台在研究hiPSC神经网络活性方面的实用性及其在新化合物筛选中的潜在用途。

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数字

图1
图1
hiPSC衍生神经元的形态学。(一个)荧光图像显示50 DPP时分化神经元的身份。神经元表达MAP2（a），其中大多数也表达vGLUT1（b），少数也表达GAD67（c）。(B类)50 DPP时神经元的层标记表达。(C类)50 DPP时神经元中兴奋性突触后标记物的表达。(D类)显示标记量化的总结图，突出显示（a）神经元命运（b）皮层标记。比例尺英寸(一个–C类) = 50微米。中的绘图(D类)表演手段 ± 标准偏差。
图2
图2
hiPSC衍生皮层神经元的内在和动作电位特性。(一个)神经元中诱导动作电位（iAP）的形成。（a） 在用Alexa Fluor 488染料填充单细胞补丁期间，hiPSC衍生神经元的典型荧光图像，突出金字塔状形态。（b） 电流注入协议用于确定修补神经元的被动和动作电位特性。细胞保持在−70 mV。（c）根据其诱导的动作电位反应对补丁神经元进行分类。全动作电位超调量>0 毫伏；列车包含≥2个全动作电位。(B类)表总结了打补丁的iPS细胞衍生神经元的内在和动作电位特性。N个 = 29（30 DPP），36（50 DPP）。(C类)hiPSC衍生神经元的自发动作电位（sAP）。（a） 电压迹线显示一个贴片细胞中存在自发活动。（b） 插图强调了高频放电的时期。（c）基于自发动作电位形成的斑贴细胞分类。有效动作电位的超调量大于0 毫伏。
图3
图3
用多电极阵列（MEA）记录hiPSC衍生神经元群体活动的变化。(一个)（a）来自相同MEA培养基的三个电极的代表性电压迹线，显示60天内活性的变化（DPP = 电镀后天数）。（b） 在培养过程中测量的基础兴奋性显示，在5次以上检测到的平均峰值频率和单单位脉冲数 分钟。(B类)将时间戳光栅数据转换为阵列范围尖峰检测率（ASDR）图，这是同步突发（SB）分析的基础。通过计算每200个峰值来创建绘图 ms-bin表示每个电极，将每个电极的计数相加，并连续绘制结果。ASDR图清楚地显示了整个文化范围内SB的发生，并允许计算SB的燃烧率、长度和间隔。(C类)培养60天后全阵列神经元活性的发展。对于每个时间点，上部面板显示光栅图，下部面板显示ASDR图。垂直比例尺 = 每200个峰值100个 中景：bin(D类)培养过程中同步爆发（SB）活性的变化显示（a）记录期内检测到的SB数量（10 分钟）；（b） SB发射率——计算为单个SB中的尖峰数/脉冲长度；（c） SB的平均长度和（d）SB之间的平均间隔。所有汇总数据均表示 ± 标准偏差。
图4
图4
hiPSC衍生皮层神经元网络活性的药理学分析。(一个)在急性暴露于NMDA、APV和GABA期间，记录相同MEA培养物的相同三个电极的过滤电压迹线一个受体抑制剂。(B类)同一MEA记录的光栅（上面板）和ASDR（下面板）图显示了在50 DPP条件下，全培养范围内对急性接触CNQX（50μM）、APV（50μM）、荷包牡丹碱（Bic，10μM）和GABA（1μM）的反应。垂直比例尺 = 每200个峰值200个 培养物中建立的网络活性依赖于AMPA和NMDA受体活性，而协调行为受GABA能调调节。(C类)显示MEA培养物对急性药物治疗的反应的汇总条形图：（a）所有药物治疗和洗涤后的基础刺突率；（b） 同步突发次数（SB）；（c） SB燃烧率和（d）荷包牡丹碱暴露后的SB间隔。所有图均显示平均值 ± 标准偏差*p < 0.05，**p < 配对t检验后0.01。阵列数量 = 50 DPP时为9。
图5
图5
hiPSC脱毒神经元培养物中的网络活性受L型电压门控钙通道的调节。(一个)急性暴露于浓度增加的L型钙通道阻滞剂地尔硫卓（60 DPP）之前、期间和之后，单个神经元MEA培养物的光栅（上面板）和ASDR图（下面板）。垂直比例尺 = 每200个峰值200个 中景：bin(B类)急性暴露于剂量增加的地尔硫卓后，MEA培养基的基本和同步活性特性的总结图：（a）基本平均峰值速率；（b） 平均同步突发次数；（c） SB的平均全培养射速；（d） SB之间的平均间隔*第页 < 0.05，根据单向方差分析后的Dunnett多重比较测试确定，其中同步脉冲数（Bb）F(7,21) = 3.324，右2 = 0.492磅/平方英寸 = 0.0107和SB间隔（Bd）F(7,21) = 6.004，右2 = 0.625及以上 = 0.0019. 所有汇总图均显示平均值 ± SD.培养基数量 = 7
图6
图6
在hiPSC衍生的神经元培养物中，对同步爆发放电周期性的影响是L型而非T型或P/Q型电压门控钙通道特有的。为了确定同步爆发（SB）之间间隔的衰减是否是由于一般电压门控钙通道活性的普遍降低，将神经元培养物暴露于替代性L型通道抑制剂硝苯地平、T型通道抑制剂ML218和P/Q型阻滞剂ω-琼脂毒素TK。（a）光栅图（上图）和ASDR图（下图）显示了一种MEA培养物在暴露于药物之前、期间和之后的自发活性。(一个)暴露于1μM硝苯地平之前、期间和之后，单个50 DPP MEA培养物的光栅和ASDR图。(B类)显示平均基础峰值速率（a）、同步脉冲数（b）和SB平均间隔（c）的汇总图。所有图均显示平均值 ± （b）中的SD.* = 第页 < 配对t检验后0.05，治疗前vs硝苯地平，t3 = 2.003; 在（d）中 = 第页 < 配对t检验后0.05，治疗前vs硝苯地平，t3 = 1.952. (C类)光栅（上面板）和ASDR（下面板）图显示了一种MEA培养物在暴露于1μM ML218和100之前、期间和之后的自发活动 nMω-琼脂毒素。在进一步用药之前，药物被洗净。(D类)显示平均（a）基础穗率（a）、SB放电率（b）和SB之间的平均间隔（c）的汇总图。所有图均显示平均值 ± SD来自7种培养物。
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