DHHC5 Mediates β-Adrenergic Signaling in Cardiomyocytes by Targeting Gα Proteins

doi:10.1016/j.bpj.2019.08.018

.2020年2月25日；118(4):826-835.

doi:10.1016/j.bpj.2019.08.018。 Epub 2019年8月22日。

DHHC5通过靶向Gα蛋白介导心肌细胞β-肾上腺素能信号

杰西卡·J·陈¹, 秋季N Marsden¹, C安东尼·斯科特², 阿斯卡尔·M·阿基姆扎诺夫¹, 达伦·博宁^三

附属公司

¹德克萨斯州休斯顿UTHealth麦戈文医学院生物化学和分子生物学系。
²德克萨斯州休斯顿贝勒医学院儿科。
^三新泽西州卡姆登罗文大学库珀医学院生物医学系。电子地址：boehning@rowan.edu。

PMID： 31547976
预防性维修识别码：项目管理委员会7036738
内政部： 2016年10月10日/j.bpj.2019.08.018

DHHC5通过靶向Gα蛋白介导心肌细胞β-肾上腺素能信号

杰西卡·J·陈等。生物物理学J. 2020.

.2020年2月25日；118(4):826-835.

doi:10.1016/j.bpj.2019.08.018。 Epub 2019年8月22日。

作者

杰西卡·J·陈¹, 秋季N Marsden¹, C安东尼·斯科特², 阿斯卡尔·M·阿基姆扎诺夫¹, 达伦·博宁^三

附属公司

¹德克萨斯州休斯顿UTHealth麦戈文医学院生物化学和分子生物学系。
²德克萨斯州休斯顿贝勒医学院儿科。
^三新泽西州卡姆登罗文大学库珀医学院生物医学系。电子地址：boehning@rowan.edu。

PMID： 31547976
预防性维修识别码：项目管理委员会7036738
内政部： 2016年10月10日/j.bpj.2019.08.018

摘要

S-棕榈酰化是一种可逆的翻译后修饰，在调节蛋白质定位、运输和稳定性方面起着重要作用。最近的研究表明，一些蛋白质在细胞刺激后经历了极为迅速的棕榈酰化/去棕榈酰化周期，支持这种翻译后修饰的直接信号作用。在此，我们研究了β-肾上腺素能刺激心肌细胞是否导致下游信号蛋白的刺激依赖性棕榈酰化。我们发现β-肾上腺素能刺激导致Gαs和Gαi棕榈酰化迅速增加。棕榈酰化动力学在时间上与cAMP下游产物和收缩反应一致。我们确定血浆膜定位棕榈酰酰基转移酶DHHC5是心肌细胞中刺激依赖性棕榈酰化的重要介质。DHHC5的敲除表明，该酶对Gαs、Gαi的棕榈酰化和β肾上腺素能刺激下游的功能反应是必要的。用纯化成分进行的棕榈酰化试验表明，Gαs和Gαi是DHHC5的直接底物。最后，我们提供了证据表明，DHHC5的C末端尾部可以在刺激下进行棕榈糖基化，这种修饰对其在质膜中的动态定位和功能很重要。我们的结果表明，DHHC5是心肌细胞β-肾上腺素能受体下游信号传导的中心调节器。

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图1
由酰基生物素交换（ABE）测定的心脏蛋白质的棕榈酰化。对H9c2细胞进行ABE(A类)，新生大鼠心室肌细胞（NRVMs）(B类)和成年大鼠左心室组织(C类). 使用Calnexin作为阳性对照。HA（−HA）的缺失被用作与链霉亲和素珠非特异性结合的阴性对照。蛋白激酶A调节亚单位（PKA R）印迹的过度暴露用（+）表示。腺苷酸环化酶；PKA C，PKA催化亚单位。

图2
异丙肾上腺素（ISO）诱导G快速可逆的棕榈酰化αs和Gαi在心肌细胞中。(A类)新生大鼠心室肌细胞（NRVM）用10μM ISO用于指定的时间。ABE用于检测棕榈酰化水平。Calnexin具有相对较慢的棕榈酰化基团更替，用于使ABE评估的更替率正常化。(B类)G的棕榈酰化水平的折叠变化αs和Gα与0分钟相比，我在指定的时间点归一化为calnexin(n个=3）。(C类)NRVM接受10次治疗μM ISO用于指示的时间点，并使用ELISA测量细胞内cAMP浓度(n个 = 5). (D类)用10μ所示时间点的M ISO。^∗第页<0.05（成对t吨-测试）。

图3
DHHC5是信号下游所必需的β-肾上腺素能受体(β心肌细胞刺激。(A类)G的棕榈酰化αs、 G公司αi、图中显示了控制中的calnexin（Cont）和DHHC5击倒（KD）。用10μ显示了指示时间点的M ISO。(B类)G的棕榈酰化水平的折叠变化αs和Gα与0分钟相比，我在指定的时间点归一化为calnexin(n个=3）。(C类)连续ISO（5分钟）前后细胞cAMP水平的定量(黑色)和DHHC5 KD(红色)NRVM(n个=3）。(D类)Fura-2在Cont中ISO（+ISO）之前（基线）和之后监测的跳动频率的量化(黑色)和KD(红色)单元格(n个=5）。^∗第页<0.05（成对t吨-测试）。N.S.=不显著。要查看此图的颜色，请联机。

图4
G公司αs和Gαi是DHHC5的直接底物。重组G的棕榈酰化α秒(A类)，Gα我(B类)和GAPDH(C类)体外模拟免疫沉淀（−）、催化活性形式的DHHC5（DHHS5）和DHHC5显示出来。作为阴性对照，添加HA以裂解所有硫酯键。通过蛋白质印迹测定的DHHC总输入显示在棕榈酰化面板下方。

图5
DHHC5 C末端尾部的棕榈酰化调节刺激依赖性的质膜运动。(A类)显示了使用Protter（41）创建的DHHC5示意图。尾部内三个潜在的棕榈酰化位点以绿色突出显示。(B类)mCherry-DHHS5和mCherry DHHS5的棕榈酰化Δ图中显示了在指定时间点用10μM ISO处理的236–245 in NRVM。Calnexin作为阳性对照。(C类)对照组细胞cAMP水平的量化(黑色)，击倒(红色)，用mCherry-DHHC5击倒并营救(绿色)或mCherry-DHHC5Δ236–245 (蓝色)显示了NRVM中的。转染mCherry-DHHC5的活NRVM的TIRF图像(D类)和mCherry-DHHC5Δ236–245 (E类)如图所示（另请参阅视频S1和S2）。(F类和*G公司*)0时粒子寿命的KDE直方图(蓝色)和10分钟(橙色)显示ISO刺激后。(*H（H）*–我)均方位移（MSD）显示在ISO刺激0到10分钟持续存在的30 s粒子窗口中。每条线代表一个粒子。n个mCherry-DHHC5=377(F类和*H（H）*)和n个mCherry-DHHC5=221Δ236–245 (*G公司*和我).^∗第页<0.05（成对t吨-测试，n个 = 3). 要查看此图的颜色，请联机。

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