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。2019年7月31日；15（7）：e1008240。
doi:10.1371/journal.pgen.1008240。 eCollection 2019年7月。

线粒体RNA周转缺陷导致体内双链RNA积累

阿列克桑德拉·帕亚克 1 2, 伊莎贝拉·莱恩 1 2, 保拉·克莱门特 1 2, 纳伊拉·埃尔·菲西 1 2, 弗洛里安·肖伯 2 三, 卡米拉·马菲奇尼 1 2, 哈维尔·卡尔沃·加里多 2 三, 罗尔夫·维博姆 1 4, 罗伯塔·菲洛格拉纳 1 2, 阿什什·迪尔 5, 安娜·韦德尔 2 三 4, 克里斯托夫·弗雷尔 1 2 4, 安娜·雷登伯格 1 2 4
附属机构

线粒体RNA周转缺陷导致体内双链RNA积累

阿列克桑德拉·帕亚克等。 公共科学图书馆-基因。 。

摘要

RNA解旋酶SUV3和多核苷酸磷酸化酶PNPase参与线粒体mRNA的降解，但它们在体内的作用尚不完全清楚。此外，上游过程，如转录成熟，与其中一些因素有关，表明线粒体RNA代谢的双重作用或紧密相连的机制。为了更好地理解线粒体RNA在体内的转换，我们操纵了果蝇模型中的线粒体mRNA降解复合体，并研究了其分子后果。此外，我们还研究了这些因子是否以及如何与线粒体多聚（A）聚合酶MTPAP以及线粒体信使核糖核酸稳定因子LRPPRC相互作用。我们的结果表明线粒体mRNA稳定性、多聚腺苷酸化和反义RNA的去除之间存在紧密的相互依赖性。此外，降解和多聚腺苷酸化的破坏导致双链RNA的积累，它们逃逸到细胞质中与苍蝇免疫反应的改变有关。我们的研究结果表明，线粒体RNA代谢的调节具有高度组织性和相互依赖性，对细胞生理学具有深远的影响。

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数字

图1
图1。DmPNPase是Dm发育所必需的线粒体蛋白。
(A类)几种真核PNPase序列的ClustalW比对，以及DmPNPase保守结构域的示意图。(B类)TOM20修饰HeLa细胞中DmPNPase-GFP融合蛋白定位的共焦分析（红色）。比例尺：5μm(C类)DmPNPase-FLAG过表达幼虫（w；；UAS）细胞核、细胞质和线粒体部分的Western blot分析-dmpnpase酶-标志/daGAL4）。使用针对FLAG肽、微管蛋白和组蛋白H3的抗体来评估组分的纯度；+指示FLAG标签肽的诱导表达。未指定的带由星号表示。(天)的qRT-PCRdmpnpase酶敲除中的转录水平（w；；dmpnpase酶击倒对手/dmpnpase酶击倒对手)和对照组（w；；）在产蛋后4天（AEL）。核糖体蛋白（RP）49转录本被用作内源性对照。(E类)对照组（w；；）和dmpnpase酶击倒对手幼虫在4天AEL时，比例尺尺寸为1mm。(如果)线粒体耗氧量dmpnpase酶击倒对手和野生型幼虫(w个;;). 使用谷氨酸、苹果酸和ADP（用于复合I驱动呼吸）、琥珀酸（用于复合II驱动呼吸）和TMPD和抗坏血酸（用于复杂IV驱动呼吸）对Oroboros氧合图进行测量。误差条表示9个独立实验的SEM，每个测量值均归一化为每个样品的蛋白质含量。(G公司)分离的呼吸链酶活性dmpnpase酶击倒对手和控制。在AEL 4天时，对幼虫的线粒体蛋白提取物进行复合物I（NADH辅酶Q还原酶）、复合物I+III（NADH-细胞色素）的评估c（c）还原酶），复合物II（NADH细胞色素c（c）还原酶），复合体III（琥珀酸脱氢酶），复合物II+III（琥酯细胞色素c（c）还原酶）和复合物IV（细胞激素c（c）氧化酶）。(H（H）)对照组和对照组线粒体蛋白提取物中线粒体编码COX3和核编码NDUFS3呼吸链亚基的Western blot分析二甲基戊烯酸击倒对手4天AEL时的幼虫。孔蛋白被用作负荷控制。（对照1:w；；，对照2:w；；dmpnpase酶击倒对手/TM6B）。所有数据均表示为平均值+/-SEM（***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，n=5）。
图2
图2。DmPNPase调节mt-mRNA的稳定性。
(A类)线粒体mRNA稳态水平dmpnpase酶击倒对手及其控件（控件1:w；；daGAL4/+和控件2:w；；dmpnpase酶击倒对手/TM6B）在4天AEL时通过qRT-PCR。RP49转录本被用作内源性对照。(B类)通过Northern印迹分析对S3B线粒体tRNA稳态水平进行量化。细胞溶胶tRNA瓦尔用于量化标准化。(C类)DmSUV3中线粒体mRNA稳态水平杜兰特（w；无人机-dmsuv3型RNAi/+；daGAL4/+），dmpnpase酶击倒对手，（w；无人机-dmpnpase酶RNAi；daGAL4/+）二甲基戊烯酸击倒对手/dmsuv3型杜兰特（w；无人机-dmsuv3型RNAi/无人机系统-二甲基戊烯酸RNAi；根据qRT-PCR测定，daGAL4/+）和对照（w；；）幼虫在4天AEL时。RP49转录本被用作内源性对照。(天)线粒体rRNA稳态水平dmpnpase酶击倒对手/dmsuv3型杜兰特通过Northern印迹法测定。RP49转录本被用作归一化的内源性对照。(E类)线粒体mRNA稳态水平dmpnpase酶运行经验（w；；无人机-dmpnpase酶/daGAL4），dmsuv3型运行经验（w；无人机-dmsuv3型/+;daGAL4/+），dmpnpase酶运行经验/dmsuv3型运行经验（w；无人机-dmsuv3型/+;无人机-dmpnpase酶/根据qRT-PCR测定，daGAL4）和对照（w；；）幼虫在4天AEL时。RP49转录本被用作内源性对照。(如果)线粒体rRNA稳态水平dmpnpase酶运行经验/dmsuv3型运行经验通过qRT-PCR测定幼虫。(G公司)Northern blot定量分析小鼠线粒体tRNAs稳态水平dmpnpase酶运行经验/dmsuv3型运行经验和对照（w；；）幼虫在4天AEL。使用针对细胞溶质tRNA的探针对凝胶的负载进行标准化和量化瓦尔所有数据均表示为平均+/-SEM（***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05，n=5）。
图3
图3。降解不需要通过mtPAP进行聚腺苷酸化，感测链受到LRPPRC的保护。
(A类,B类)ND1转录物3′RACE分析后单个测序克隆的Poly（A）尾部长度dmpnpase酶杜兰特,dmpnpase酶杜兰特/dmsuv3型杜兰特,dmsuv3型运行经验,dmpnpase酶运行经验,dmpnpase酶运行经验/dmsuv3型运行经验，并在4天AEL时控制（w；；）幼虫。(C类)线粒体mRNA稳态水平的量化dmpnpase酶运行经验(dmmtpap公司击倒对手/FM7；；无人机-dmpnpase酶/daGAL4或FM7；；无人机-dmpnpase酶/daGAL4或FM7/Y；；无人机-dmpnpase酶/daGAL4），dmmtpap公司击倒对手(dmmtpap公司击倒对手/Y、 ；）dmpnpase酶运行经验/dmmtpap公司击倒对手(dmmtpap公司击倒对手/是；；UAS公司-dmpnpase酶/daGAL4）和对照（w；；）幼虫。组蛋白用作负荷控制。(天)线粒体mRNA稳态水平dmlrpprc1型杜兰特,dmlrpprc1型杜兰特/dmsuv3型杜兰特,dmlrpprc1型杜兰特/dmpnpase酶杜兰特根据qRT-PCR测定，在4天AEL时控制（w；；）幼虫。RP49被用作内源性对照。(E类)ND1转录物多（A）尾的3′RACE分析dmlrpprc1型杜兰特（w；；无人机-平衡计分卡RNAi#1/daGAL4），dmlrpprc1型杜兰特/dmsuv3型杜兰特（w；无人机-dmsuv3型RNAi/+；无人机-平衡计分卡RNAi#1/daGAL4），dmlrpprc1型杜兰特/dmpnpase酶杜兰特（w；无人机-dmpnpase酶RNAi/+；无人机-平衡计分卡RNAi#1/daGAL4）和对照（w；；）幼虫在4天AEL时。所有数据均表示为平均值+/-SEM（***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，n=5）。
图4
图4。线粒体dRNAs在没有mtPNPase、SUV3和mtPAP的情况下积聚并定位于细胞质。
(A类)使用从4天AEL幼虫中分离的总RNA进行甲醛-淀粉凝胶电泳的Northern blot分析。用双链DNA探针和反义链寡核苷酸探针检测信号。核编码RP49被用作加载控制。(B类)COX1转录物和COX1反义链的Poly（A）尾部长度在3′RACE实验后的单个测序克隆中二甲基戊烯酸杜兰特（n=22和n=31）和野生型对照（w；；，n=23和n=5）幼虫在4天AEL时。(C类)在对照的4天AEL时从幼虫分离的总RNA的Northern印迹，dmsuv3型杜兰特,dmpnpase酶击倒对手,dmmtpap公司击倒对手、和dmlrpprc1型杜兰特如图所示，用不同的核糖核酸酶处理。用5种不同的探针检测线粒体转录物的印迹，并用RP49作为负荷对照。(天)用J2抗体（红色）对对照幼虫解剖大脑中的dsRNA进行免疫染色，dmpnpase酶击倒对手,dmsuv3型杜兰特,dmmtpap公司击倒对手、和dmlrpprc1型杜兰特线粒体用ATP5a抗体染色（绿色），细胞核用DAPI染色（蓝色）。
图5
图5。细胞质定标的线粒体dsRNA影响细胞抗病毒反应途径。
(A类)箱线图显示了对照组和dmpnpase酶击倒对手飞行模型（n=2）。(B类)qRT-PCR分析从对照组幼虫分离的细胞液中的mtCOX1、mtND5、mtND3和mtND2，dmpnpase酶击倒对手,dmsuv3型杜兰特、和dmmtpap公司击倒对手并用核糖核酸酶III处理。数据表示为平均+/-扫描电镜(C类)对照组幼虫Dicer2、Ago2和R2D2转录水平的qRT-PCR分析，dmlrpprc1型杜兰特,dmpnpase酶击倒对手,dmsuv3型杜兰特、和dmmtpap公司击倒对手所有数据均表示为平均+/-SEM（***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，n=5dmlrpprc1型杜兰特,dmpnpase酶击倒对手、和dmsuv3型杜兰特对于，n=3dmmtpap公司击倒对手).
图6
图6。线粒体转录物拟议降解途径示意图。
POLRMT对多顺反子转录物的转录是由线粒体基因组（mtDNA）每条链上的两个启动子启动的。在MTPAP将短聚（A）延伸添加到有义和反义RNA的3′端以及可能添加到选定的tRNA之前，由RNase P和RNase Z复合物（未显示）进行对单个未成熟转录物的处理。编码RNA由LRPPRC/SLIRP复合物稳定，成熟并以MTPAP/LRPPRC/SUV3依赖方式完全聚腺苷化。一种未知的机制是通过PNPase/SV3复合物直接靶向反义RNA进行降解。在没有降解或多聚腺苷化的情况下，反义RNA被稳定下来，从而形成dsRNA，这些dsRNA通过未知机制从线粒体基质中排出。线粒体衍生核酸的积累和/或OXPHOS功能障碍触发抗病毒免疫反应。
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出版物类型

MeSH术语

赠款和资金

本研究得到瑞典研究委员会[AW（VR2016-02179），AWe（VR2016-1082）]的支持；Knut&Alice Wallenberg基金会（AW and AWe（KAW 2013.0026））。该项目已获得欧洲研究委员会（ERC）根据欧盟地平线2020研究与创新计划（赠款协议编号715009）提供的资金。AW是Ragnar söderberg医学研究员（M77/13）共聚焦成像是在瑞典卡罗林斯卡研究所生物科学与营养系活细胞成像单位/尼康卓越中心进行的，由克努特和爱丽丝·沃伦伯格基金会、瑞典研究委员会、，创新医学中心和Jonasson对瑞典Kungliga Tekniska Högskolan科技与健康学院的捐赠。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。