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.2019年7月18日；132（14）：jcs232330。
doi:10.1242/jcs.232330。

Sumoylation调节减数分裂染色体分离过程中的蛋白质动力学秀丽线虫卵母细胞

费德里科·佩利施 1, 劳拉·贝尔·博尔贾 2, 埃利斯·G·贾夫雷 2, 罗纳德·T·海 2
附属公司

Sumoylation调节减数分裂染色体分离过程中的蛋白质动力学秀丽线虫卵母细胞

费德里科·佩利施等人。 细胞科学杂志. .

摘要

大多数物种的卵母细胞减数分裂纺锤体缺乏中心体，无着丝粒减数分裂纺锤体中忠实染色体分离的机制尚不清楚。在秀丽线虫卵母细胞、纺锤形微管对染色体施加极向力，该力依赖于微管稳定蛋白CLS-2，即哺乳动物CLASP蛋白的同源物。检查点激酶BUB-1和CLS-2定位于中央纺锤体，并在整个后期显示动态定位模式，但调控其后期特异定位的信号尚不清楚。我们之前已经表明，SUMO在中期I调节BUB-1的定位。在这里，我们发现BUB-1的SUMO修饰由SUMO E3连接酶GEI-17和SUMO蛋白酶ULP-1调节。在早期后期I，分离染色体之间的BUB-1定位需要SUMO和GEI-17。我们还表明CLS-2受SUMO介导的调控；当SUMO或GEI-17耗尽时，CLS-2提前定位于中二价体。总的来说，我们为SUMO介导的卵母细胞早期后期I蛋白质动力学的新控制提供了证据。

关键词：染色体；减数分裂；卵母细胞；SUMO；隔离；主轴。

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数字

图1。
图1。
后期I的SUMO动力学。（A） 在一株表达GFP：：SUMO的菌株的活卵母细胞中，对整个减数分裂I过程中的SUMO定位进行了跟踪。一张单人床z（z）-切片显示在图像中。（B） 从图像中量化SUMO信号，如图A所示。该图显示平均值±标准偏差(n个=5). （C） SUMO E3连接酶GEI-17在表达GFP:：GEI-17的卵母细胞的减数分裂I中定位。（D） GFP:：GEI-17图像强度的量化，如C所示。图表显示平均值±标准误差(n个=3). 比例尺：2µm。
图2。
图2。
后期I期间的SUMO、BUB-1和AIR-2动态。（A） 在固定样本中分析了BUB-1和AIR-2在不同减数分裂I阶段的定位。注意，BUB-1和AIR-2在中期在中二价环结构域中共定位，并且随着后期的进展，它们的共定位降低。最终，BUB-1从主轴中消失，AIR-2的大部分存在于中心主轴中。青色箭头表示环畴定位，而黄色箭头表示杆状拉伸环畴的外缘，其中AIR-2而非BUB-1定位。每张图像的染色体距离显示在右侧，作为近似后期进展的指南。（B） 在表达BUB-1：：mCherry和GFP：：AIR-2（FGP132株）的卵母细胞减数分裂I期间，跟踪BUB-1和AIR-2的定位。黄色箭头表示AIR-2和BUB-1共定位的位置。（C） 在表达BUB-1：：mCherry和GFP：：SUMO（FGP26株）的卵母细胞减数分裂I期间，跟踪BUB-1和SUMO的定位。请注意，在动粒分离后（从60秒起），BUB-1与SUMO完美结合。比例尺：2µm。
图3。
图3。
BUB-1是SUMO底物，其定位受SUMO调节。（A） BUB-1与越来越多的UBC-9孵育，并用SDS-PAGE分析其与SUMO的修饰。（B） 将BUB-1与限量的UBC-9和浓度不断增加的SUMO E3连接酶GEI-17一起孵育，并通过SDS-PAGE分析所得反应以评估BUB-1的酰化作用。（C） RNAi耗尽SUMO或GEI-17，在内源性位点表达BUB-1:：GFP的菌株（FGP51菌株）中进行BUB-1定位。比例尺：2µm。（D） 后期中央心轴BUB-1:：GFP信号的量化。该图显示平均值±标准偏差n个针对每个条件。（E） 显示在BUB-1或SUMO耗尽后的后期I中具有滞后染色体的卵母细胞百分比的图表。示例图像显示在右侧。影响烟雾-1（RNAi）采用Fisher精确试验进行分析，与对照卵母细胞相比，未观察到显著差异(P（P）=0.14).
图4。
图4。
ULP-1是一种活性SUMO蛋白酶体内和在体外.（A） 野生型或ulp-1型（RNAi）喂养的蠕虫使用抗GFP纳米体进行免疫沉淀。免疫沉淀用抗GEI-17和-SUMO抗体进行免疫印迹分析。（B） 重组Alexa Fluor 680（AF680）–SUMO修饰的GEI-17与不断增加的ULP-1孵育。反应在SDS-PAGE上进行，并在激光扫描仪中进行扫描。凝胶上不同物种的身份如右图所示。（C） 重组全长SMO-1–HA与不断增加的ULP-1孵育，在SDS-PAGE上运行产生的反应，并通过考马斯染色进行分析，以分解处理的[SMO-1（GG）']和未处理的SUMO[SMO-1（GGF）–HA']。
图5。
图5。
ULP-1耗尽和BUB-1定位。（A） ULP-1使SUMO与BUB-1解偶联。全长，在体外-翻译的ULP-1（或裂解物对照）与SUMO修饰的BUB-1孵育，并通过western blotting进行分析。（B） 在切割的卵母细胞减数分裂I期间分析了内源性、GFP标记的ULP-1定位。比例尺：2µm。（C） 对照（野生型）或ULP-1缺失的卵母细胞在减数分裂I过程中进行BUB-1:：GFP定位[ulp-1（RNAi）]. 比例尺：2µm。（D） 后期发病后90秒BUB-1:：GFP水平的定量。显示了四分位范围的中位数。使用未配对的t吨-用韦尔奇修正进行测试(P（P）=0.01476). （E） 在ULP-1缺失后，在固定样本中评估BUB-1定位[ulp-1型（RNAi）]使用BUB-1特异性抗体。比例尺：2µm。黄色箭头表示ULP-1耗尽后BUB-1积聚的病灶。（F） ULP-1缺失后后期BUB-1和SUMO共定位。黄色箭头表示BUB-1的异常积累及其与SUMO的共定位。比例尺：2µm。（G） 分析野生型和ULP-1缺失卵母细胞的染色体分离。平均值±标准误差n个显示了每个条件的值。
图6。
图6。
CLS-2的定位在早期后期由SUMO调节。（A） 在野生型和SUMO缺失卵母细胞的后期I（使用菌株JDU38）中追踪CLS-2:：GFP和mCherry:：组蛋白[烟雾-1（RNAi）]。中的黄色箭头烟雾-1（RNAi）处理的卵母细胞表明早期中二价/中央纺锤体CLS-2定位。（B） 在发病后期30秒后，沿纺锤体轴进行40像素宽的线扫描，显示CLS-2:：GFP和mCherry:：组蛋白强度曲线。（C） 与A中相同，但在耗尽SUMO E3连接酶GEI-17后[gei-17（RNAi）]；BUB-1型[bub-1型（RNAi）]缺失被用作参考。比例尺：2µm。
图7。
图7。
BUB-1和CLS-2的急性耗竭。（A） 内源性BUB-1被生长素诱导降解物（AID）和GFP标记。表达未标记TIR1的蠕虫用载体（乙醇）或生长素（IAA）处理、解剖，并对卵母细胞成像。黄色箭头突出了BUB-1缺失后观察到的早期后期染色体分离缺陷，而青色箭头标记了后期中期和晚期的滞后染色体。比例尺：2µm。（B） 内源性CLS-2被标记为AID和GFP，其定位和耗尽的影响与A一样进行分析。在所有情况下，分离失败，没有极体被挤压。比例尺：2µm。
图8。
图8。
两步染色体分离模型和SUMO的作用。（A） 在后期早期，染色体开始分离，其间没有MT。该区域充满BUB-1和SUMO等蛋白质，表明这些蛋白质可能在早期分离步骤中发挥作用。随着后期的进展，MT在分离染色体之间的区域填充，从而进入CLS-2依赖期。（B） 描述了整个后期环域和中心纺锤的动态组成。
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