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.2018年12月10日7:e42908。
doi:10.7554/eLife.42908。

GIRK通道和GPCR之间信号特异性的分子基础

Kouki K Touhara公司 1, 罗德里克·麦金农 1
附属公司

GIRK通道和GPCR之间信号特异性的分子基础

Kouki K Touhara公司等。 埃利夫. .

摘要

受刺激的毒蕈碱型乙酰胆碱受体（M2Rs）释放Gβγ亚单位，通过激活G蛋白门控的K来减缓心率+通道（GIRK）。受刺激的β2肾上腺素能受体（β2ARs）也会释放Gβγ亚基，但GIRK不被激活。本研究探讨了M2Rs.K激活GIRK这种特异性的机制+标记G蛋白和GIRK之间的电流和生物发光共振能量转移表明，M2Rs催化Gβγ亚基释放的速率高于β2ARs，产生更高的Gβγ浓度，激活GIRK并调节Gβγ的其他靶点。与β2AR相比，Gβγ释放速率较高是因为M2R中G蛋白偶联受体-G蛋白三聚体结合速率更快。因此，单个动力学步骤中的速率差异可解释特异性。

关键词：G蛋白；GIRK；GPCR；人；离子通道；分子生物物理学；小鼠；结构生物学。

PubMed免责声明

利益冲突声明

KT、RM未宣布竞争利益

数字

图1。
图1.GPCR和GIRK通道之间的Gβγ特异性。
(一个)GPCR信号转导和GIRK通道激活的示意图。激动剂结合促进GPCR-Gα（GDP）βγ复合物的形成。激活的GPCR随后触发Gα亚基上GDP与GTP的交换。Gα（GTP）和Gβγ亚基随后从GPCR中分离。分离的Gβγ直接结合并激活GIRK通道。分离的Gα（GTP）水解GTP生成GDP，然后与Gβγ再结合形成Gα（GDP）βγ。(B类)急性分离小鼠窦房结（SAN）细胞自发动作电位的典型电流灯记录。如图所示，使用1µM异丙肾上腺素（Iso）或乙酰胆碱（ACh）。(C类)中同一SAN单元的典型电压灯记录(B类). 膜电位保持在−80 mV，如图所示施加1µM Iso或ACh。(D类)与GIRK通道以及M2Rs、β2ARs或β1ARs瞬时共转染的HEK-293T细胞的典型电压灯记录。膜电位保持在−80 mV。如图所示，施加10µM ACh或Iso。(E类)βAR功能验证。用10µM普萘洛尔（Pro）或异戊烯醛（Iso）处理表达βAR的HEK-293T细胞或未转染的HEK-29.3T细胞（Ctrl），并量化细胞内cAMP水平（N=3，±SD）。另请参见图1-图补充1。
图1——图补充1。
图1补充了异源表达GIRK通道中的1..Gβγ特异性。
(一个)内源性M2Rs不激活GIRK。用GIRK通道瞬时转染HEK-293T细胞。膜电位保持在−80 mV。如图所示，施加10µM ACh。(B类) (C类)表达M2Rs或β2ARs的HEK-293T细胞的共焦图像。瞬时转染HEK2-93T细胞(B类)SNAP-M2R或(C类)SNAP-β2ARs。使用Alexa Fluor 488与SNAP配体偶联物对受体进行染色。显示了每个受体的三个代表性图像。(D类)与GIRK通道以及M2Rs、β2ARs或β1ARs瞬时共转染的CHO细胞的典型电压灯记录。膜电位保持在−80 mV。如图所示，施加10µM ACh或Iso。通过定量细胞内cAMP（N=3，±SD）验证βARs的功能。(E类)与GIRK通道以及M2Rs、β2ARs或β1ARs共同感染的Sf9细胞的典型电压灯记录。膜电位保持在−80 mV。如图所示，施加10µM ACh或Iso。通过定量细胞内cAMP（N=3，±SD）验证βARs的功能。
图2。
图2.人工强制GPCR-GIRK联合定位的效果。
(一个)GPCR-GIRK连接构件的示意图。GIRK直接融合到GPCR的C末端。一个可切割的信号肽和一个Halo标记被添加到每个连接的N末端。此外，在每个连接的C端添加了SNAP标记。(B类)GPCR-GIRK连接结构的Western-Blot分析。用M2R-GIRK或β2AR-GIRK-concatemers瞬时转染HEK-293T细胞。这些级联的预期大小为~150 kDa。(C类) (D类)瞬时转染M2R-GIRK级联或β2AR-GIRK级联的HEK-293T细胞的代表性电压灯记录。膜电位保持在−80 mV。如图所示，施加10µM ACh或Iso。(E类)β2AR-GIRK连接的功能验证。用10µM普萘洛尔（Pro）或异丙肾上腺素（Iso）处理表达β2AR-GIRK级联物的HEK-293T细胞，并量化细胞内cAMP水平（N=3，±SD）。
图3。
图3 G蛋白水平对特异性的影响。
(一个)M2R激动剂ACh诱导的GIRK电流。用表达GFP（Ctrl）、Gαi1号机组，或Gαi1号机组γ和Gβ。施加10µM ACh，并将诱发的内向电流归一化为细胞的电容（±SEM）。(B类)β2AR激动剂Iso诱导的GIRK电流。用表达GFP、Gα秒，或Gα秒和Gβγ。应用10µM Iso，将诱发的内向电流归一化为细胞的电容（±SEM）。(C类)BRET分析的示意图。在GPCR的激动剂刺激下，Gβγ-Venus被释放。然后Gβγ-金星与GIRK-NLuc结合，增加BRET信号。(D类) (E类)刺激GPCR后BRET信号的典型变化。在(D类)、HEK-293T细胞转染M2Rs、Gβγ-Venus、GIRK-NLuc，并增加Gαi1号机组.英寸(E类)，HEK-293T细胞转染β2ARs、Gβγ-Venus、GIRK-NLuc，并增加Gα秒在t=5s时使用激动剂。另请参见图3图补充剂1和2。
图3——图补充1。
图3：图补充剂1.β2ARs在过度表达G蛋白三聚体的情况下激活GIRK通道。
(一个)HEK-293T细胞稳定表达M2Rs和GIRK的典型电压灯记录。细胞瞬时转染Gαi1号机组和Gβγ。(B类)稳定表达β2ARs和GIRK的HEK-293T细胞的典型电压灯记录。细胞瞬时转染Gα秒和Gβγ。(C类)表达M2R、Gα的HEK-293T细胞的代表性时间分辨BRET比值曲线i1号机组、Gβγ-金星和masGRK3ct-NLuc，已知其与Gβγ相互作用。(D类)表达M2R、Gα的HEK-293T细胞的代表性时间分辨BRET比值曲线i1号机组，Gβγ-金星，和Kir2.2-NLuc，另一种内向批发剂K+结构类似于GIRK但不与Gβγ结合的通道。(E类)刺激GPCR后BRET信号的正常化变化。在存在不同Gα表达水平时测量ΔBRET比率，并将其归一化为存在4×Gα时的比率（N=6–8，±SEM）。
图3——图补充2。
图3补充图2 HEK-293T细胞内源性Gα水平的比较。
(一个)抗体特异性评估。不同的Gα蛋白被异源表达、纯化并用Western Blot分析。抗Gαi1号机组抗体识别两种Gαi1号机组和Gα第3页.抗-Gαi2类，Gαo个和Gα秒抗体特异性识别其目标Gα。(B类)HEK-293T细胞内源性Gα水平的比较。HEK-293T细胞经Western Blot分析。加载5 ng纯化的Gα作为参考。
图4。
图4 Gα的泛化我-耦合GPCR靶向特异性。
(一个)Gβγ抑制TRPM3通道的示意图。在激动剂刺激下，释放的Gβγ直接结合并抑制TRPM3通道。(B类)GPCR刺激后阻断的电流量被归一化为第一峰值电流（±SEM）。(C类)-(F类)瞬时转染HEK-293T细胞的典型电压灯记录(C类)TRPM3和M2R(D类)TRPM3和β2ARs(E类)TRPM3、β2ARs和Gα秒，或(F类)TRPM3、β2ARs、Gα秒和Gβγ。每秒将−100 mV至+100 mV的斜坡协议应用于电池。绘制了+100 mV的电流。用10µM硫酸孕烯醇酮（PS）诱发TRPM3电流。M2Rs和β2ARs分别由10µM ACh和Iso刺激。
图5。
图5..Gα秒（GTP-γS）和Gαi1号机组（GTP-γS）不与GIRK通道竞争Gβγ。
(一个)His之间竞争分析的示意图10-重组平面脂质双层系统中Gα（GTP-γS）和Gβγ的GIRK。在这些实验中，我们控制了脂质相关Gα（GTP-γS）的含量以定量评估竞争。我们首先将一定量的Ni-NTA-类脂质加入到脂质双层中，并应用足够的His10-Gα（GTP-γS）使所有可用的Ni-NTA结合位点饱和（图5补充图1B-1D）。系上他的10-Gα（GTP-γS）与GIRK竞争Gβγ，因此抑制GIRK(B类)His电流抑制10-Gα（GTP-γS）归一化为初始电流水平（N=3，±SD）。(C类) (D类)脂双层的典型内向GIRK电流。GIRK被PIP部分激活2，纳+以及低浓度的Gβγ。虚线表示基线电流（0 pA）。(C类)他的10-Gαi1号机组（GTP-γS）或(D类)他的10-Gα秒（GTP-γS）直接灌流到双层膜多次，然后在双层室中混合溶液。应用Gα（GTP-γS）时电流的瞬态下降是由于Na的缺乏而造成的伪影+在他的10-Gα（GTP-γS）溶液。另请参见图5——图补充1。
图5——图补充1。
图5-图补充1…净化他的10-Gα（GTP-γS）与含有Ni-NTA脂质的GUV膜结合。
(一个)GIRK通道被少量Gβγ部分激活。将含有GIRK和Gβγ的蛋白脂质体以1:0.1（wt:wt）的比例融合到平面脂质双层膜上。然后通过添加32µM C8-PIP激活GIRK2和32 mM Na+到双层室（左迹线）。随后，通过融合Gβγ囊泡（右迹线），GIRK被完全激活。内向GIRK电流增加了约5倍，表明GIRK通道部分激活，因为左侧示踪中存在限制数量的Gβγ。(B类)巨大单层囊泡（GUV）赤道平面的典型共焦图像。相应浓度的Alexa Fluor 488标记的His10-Gαi1号机组（GTP-γS）。(C类) (D类)Gα（GTP-γS）与GUV的结合曲线。采用1:1结合模型拟合不同蛋白质浓度下测得的荧光强度。
图6。
图6 Gα释放Gβγ的相对速率我与Gα秒-耦合受体。
(一个)BRET监测Gβγ释放的实验示意图。在激动剂刺激下，GPCR释放Gα和Gβγ。Gα-Venus和Gβγ-NLuc的解离导致BRET信号的减少。释放的Gβγ-NLuc被masGRK3ct螯合，masGRK3的C末端PH结构域与肉豆蔻酸连接肽融合。(B类)-(E类)具有代表性的时间分辨BRET比率曲线。在(B类)和(C类)在同一时间段内，M2Rs释放的Gβγ多于β2ARs，与使用Gα-Venus结构无关。在(D类)和(E类)在同一时间段内，D2Rs比β1ARs释放更多的Gβγ，与使用Gα-Venus结构无关。另请参见图6图补遗1和2以及表1。
图6——图补充1。
图6补充图1。与β2AR相比，M2R催化Gβγ的释放速度更快。
(一个)Gα之间的结构比较秒和Gαi1号机组Gα的晶体结构秒（蓝色，PDB:1AZT）和Gαi1号机组（红色，PDB:1GG2）叠加。金星插入位置如箭头所示。残基Gα的Cα原子秒-113和144，以及Gαi1号机组-91和121表示为球体。(B类) (C类)瞬时转染不同GPCR和Gα-Venus构建物的HEK-293T细胞的时间分辨BRET比值曲线。
图6——图补充2。
图6-图补充2.D2Rs以比β1ARs更高的速率催化Gβγ的释放。
(一个)瞬时转染GIRK通道和D2R的HEK-293T细胞的代表性电压灯记录。膜电位保持在-80 mV。如图所示，应用10µM多巴胺（Dopa）。(B类)静脉插入Gα的功能验证秒显示了瞬时转染β1ARs和不同Gα-Venus结构的HEK-293T细胞的时间分辨BRET比值曲线。(C类) (D类)瞬时转染不同GPCR和Gα-Venus构建物的HEK-293T细胞的时间分辨BRET比值曲线。
图7。
图7 Gβγ特异性的动力学模型。
(一个)用于模拟GIRK的GPCR活化的反应方案。k个xy公司是两个G蛋白状态之间反应的速率常数。表2总结了速率常数、平衡常数和协同常数。(B类)来自两个不同SAN细胞的ACh刺激GIRK电流以灰色显示。计算GIRK-βγ4浓度随时间的变化k个12震级以黑色实心和虚线曲线表示。(C类)计算稳态GIRK-βγ4浓度随k个12震级。(D类)稳态二维Gβγ浓度剖面（分子µm−2; 单分子µm−2=0.2µM，在膜表面以下80º厚的层中），围绕单个GPCR，产生1 Gβγsec−1平均Gβγ寿命为1s，扩散系数为0.2µm2秒−1. (E类)Gβγ在半径为0.3µm、密度为50 GPCRµm的热点及其周围的稳态二维浓度分布−2Gβγ寿命和扩散系数与(D类). (F类)中浓度剖面的二维横截面(D类)和(E类). (G公司)热点中心的稳态Gβγ浓度是热点半径的函数。另请参见图7图补充1和表2。
图7——图补充1。
图7-图补充1.GIRK的GPCR激活模拟。
(一个)计算的受体和G蛋白浓度随时间变化(k个12=1µM−1秒−1). (B类)毒蕈碱部分激动剂在有限程度上激活GIRK通道。在表达M2R和GIRK通道的稳定HEK-293T细胞上进行全细胞电压灯记录。膜电位保持在−80 mV。如图所示，施加10µM ACh、100µM Oxotremorine（Oxo）或100µM Pilocarpine（Pilo）。(C类)部分激动剂激活的GIRK电流标准化为ACh激活的GIRK电流（N=5-6，±SEM）。(D类)不同激动剂刺激M2R后BRET信号的典型变化。HEK-293T细胞转染M2Rs、Gβγ-Venus、GIRK-NLuc，并增加Gαi1号机组在t=5 s时，施用5µM乙酰胆碱（ACh）、50µM氧三嗪（Oxo）或50µM毛果芸香碱（Pilo）。
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中的注释

  • doi:10.7554/eLife.44298

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