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.2018年11月7日；100（3）:564-578.e3。
doi:10.1016/j.euron.2018.09.018。 Epub 2018年10月4日。

癫痫偶联促进小脑浦肯野细胞同步放电

Kyung-Seok Han先生 1, Chong Guo公司 1, 克里斯托弗·H·陈 1, 劳伦斯·维特 1, 托马斯·奥索诺 1, 韦德·G·雷格尔 2
附属公司

癫痫偶联促进小脑浦肯野细胞同步放电

Kyung-Seok Han先生等。 神经元. .

摘要

不同时间尺度的相关神经元活动在信息传递和处理中起着重要作用。我们发现，在处于清醒状态的小鼠中，相邻Purkinje细胞（PC）意外地有很大一部分表现出亚毫秒的同步性。相关放电通常来自化学或电突触，但令人惊讶的是，两者都不需要产生PC同步。因此，我们评估了脑耦合，这是一种神经元通过细胞外电信号进行交流的机制。在新皮质中，来自许多神经元的脑电信号在缓慢的时间尺度上叠加，产生峰值，但来自单个细胞的细胞外信号被认为太小，无法同步放电。这里我们发现，单个PC产生足够大的细胞外电位，以打开附近PC轴突中的钠通道。由于PC产生的脑电信号在动作电位上升阶段达到峰值，因此可以实现快速同步。这些发现表明，脑型耦合有助于邻近PC的普遍同步化。

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利益冲突声明

利益声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1。
图1.清醒行为小鼠邻近Purkinje细胞放电的相关性。
（A） 示意图显示了录制配置和运行轮上的头戴式鼠标。（B） 显示蚓部V小叶中电极位置的示意图（左）以及电极和PC的近似比例（右）。（C） 显示两个站点同时记录的活动的原始跟踪。复杂峰值用*表示。（D） （顶部）PC轨迹与记录在一个电极上的大峰值的每个峰值对齐。这些大峰值显示超过5 ms的不应期，表明这是一个单独的隔离单元（PC1）。（中间）另一个电极的类似排列显示出第二个隔离单元（PC2）。（底部）与PC1峰值对齐的PC2峰值显示在±1 ms内聚集了许多峰值。（E）显示（D）较低记录道峰值计数的直方图显示，PC1和PC2在快速时间尺度上显示相关性。灰色框是用于计算同步指数的窗口。（F） 21对样品的峰值计数直方图平均值，阴影灰色为±S.E.M.（G）同步指数，作为电极距离的函数。黑色圆圈表示具有统计意义的同步性（Z得分>3，见方法）。灰色表示不同步的对。（H） 直方图显示了成对PC的同步性指数的分数出现。黑色箱包括所有表现出显著同步性的对，灰色箱是不相关的对。
图2。
图2 Purkinje细胞的同步放电不需要突触传递。
（A） 脑切片中测量PC自发动作电位的四次记录示意图。分子层（ML）、浦肯野细胞层（PCL）和颗粒层（GL）。（B） 两台PC（黑色）之间自发放电的典型交叉相关图（0.05 ms bins）。（C） 平均交叉相关图（n=104个PC对）。（D） 作为距离函数的PC对的同步索引。（E） 同步指数直方图。（F–I）与（B–E）相同，但快速谷氨酸能和GABA能传输被NBQX、CPP和GABAzine（红色）阻断（n=91个PC对）。（J，K）在NBQX、CPP和GABAzine（蓝色）（n=211个PC对）存在下，对细胞体彼此位于20μm以内的PC细胞对进行了附加实验。（J） 平均交叉相关图。（K） 同步指数直方图。蓝色箱子包括所有表现出显著同步性的配对（Z得分>3，见方法），灰色箱子是非相关配对。C、G和J中的阴影误差条为S.E.M。
图3。
图3非突触同步活动不需要间隙连接耦合。
在NBQX、CPP和GABAzine存在的情况下，从细胞体彼此相距20μm以内的PC上获得配对记录，以阻断谷氨酸能和GABA能突触。（A） 全细胞记录配置示意图，其中从附近的PC对中获取细胞内记录和全细胞记录。（B） 通过细胞内记录显示同步放电的PC对确定的交叉相关图。（C） 对B中的细胞对进行了全细胞记录，并通过向一个PC中注入-5 nA并测量另一个细胞中的电压来评估间隙连接耦合。（D） PC对中观察到的电压变化率与电池对显示的同步度的函数关系。线性回归（红线，R2=0.0044). （E） 从一对PC测得的交叉相关图显示，在存在GABA和谷氨酸受体阻滞剂（左）和添加缝隙连接阻滞剂2-APB（右）的情况下，通过细胞内记录同步放电。（F） 2-APB对相邻PC之间相关性的影响总结。配对t检验（P=0.55）。
图4。
图4：动作电位在邻近Purkinje细胞中引发电流，该电流与同步放电程度高度相关，并被QX314消除。
（A） 相邻两台PC之间自发放电的交叉相关图显示同步放电。在全细胞记录之前，通过细胞内记录测量自发动作电位。（B） 对于A中的细胞对，允许一个PC在电流钳中自发激发，并在电压钳中在3个不同电位下确定另一个PC中的尖峰触发平均（STA）电流。（C，D）对未同步触发的PC对进行了与（A，B）类似的实验。（E，F）与（A，B）相同，但超极化用于抑制自发放电，并使用带有泊松模式的电流注入（5 nA，1 ms）来刺激放电。（G）在−50 mV时诱发的电流大小与同步指数正相关。线性回归（红线，R2=0.87）。（H） 与G相同，但用于泊松刺激（红线，R2=0.82). （一） 通过细胞内记录，两个附近PC之间自发放电的交叉相关图。（J） 一台PC通过泊松刺激诱发动作电位，而另一台PC则通过钙通道拮抗剂尼莫地平、TTA-P2和ω-芋螺毒素-MVIIC在浴中阻断L-、T-、P/Q-和N-型钙通道，进行全细胞电压灯记录。（K） 用钙离子通道拮抗剂在−50 mV的保持电位下测得的STA电流振幅是同步指数大小的函数。线性回归（红线，R2=0.80). （L–N）与（I–K）相同，但从一台PC上记录自发动作电位，并使用含有非选择性钠通道拮抗剂QX314（1 mM）的吸管从另一台PC获得电压灯记录。
图5。
图5 Purkinje细胞峰值产生的细胞外信号
（A） 用Alexa染料标记的代表性PC图像。每个数字表示树突（1-5）、轴突起始段（AIS，6）、轴轴突（7-10）和细胞外间隙（11-20）的动作电位以10μm的增量记录细胞外电压变化的区域。虚线表示PC层。（B） 躯体动作电位和（A）所示相应区域的细胞外动作电位（eAP）。（C） eAP与体细胞的距离汇总（体细胞区域1-10）。（D） eAP与AIS的距离汇总（（A）中区域11至区域20）。（E） 用Alexa染料标记的代表性PC图像。细胞外电压的记录区域从轴突（距体部>100μm，4，5）和轴突侧支（距体1–3>100μm）变化。（F） 体细胞和eAP在（E）中所示的相应区域的动作电位。（G） AIS（距躯体10μm）、轴突（>100μm）和轴突侧支（>100微米）的细胞外电压变化总结。AIS，−458±35μV；Axon，−11.9±1.4μV，侧支，−33±4μV。C、D和G中的误差条是S.E.M.（H）从头固定清醒小鼠探针上的16个通道（灰色方块）中的每个通道测得的细胞外电压响应。电极尺寸和位置按比例绘制，距离由I中的比例尺提供。（I）eAP的幅值是通道和电池估计位置（n=15个电池）之间距离的函数。每个灰色圆圈表示不同电极的测量值。暗跟踪是使用自定义函数的一种适合（请参见方法）。
图6。
图6轴突起始段附近的细胞外刺激引发的电流与附近Purkinje细胞中的棘波所诱发的电流类似。
实验中，将细胞外电极放置在轴突起始段附近，并使用由测量的细胞外动作电位波形确定时间进程的电流来刺激轴突（红色痕迹）。（A） 原理图。（B） 细胞外刺激引起的放电的交叉相关图。（C） 细胞外刺激电流（红色）和在相应的保持电位（蓝色）下用全细胞电极测量的电流。总结了18个细胞的结果50毫伏，25.2±3.6毫安60毫伏，3.8±0.9 pA；−70 mV，0.8±0.6 pA50毫伏，3.1±0.9毫安60毫伏，0.8±0.5毫安；−70 mV，0.2±0.1 pA。（E）C中的As，但存在钙通道拮抗剂50毫伏，24.4±5.2毫安60毫伏，3.5±1.1毫安70 mV，0.8±0.3 pA。（F）C中为As，但细胞内电极中为1 mM QX31450毫伏，0.3±0.1毫安；−60 mV，0.5±0.1 pA；−70 mV，0.3±0.1 pA50毫伏，0.5±0.1毫安；−60毫伏，0.4±0.1毫安；−70毫伏，0.3±0.1毫安。
图7。
图7：同步活动的程度和每个PC轴突起始段之间的距离密切相关。
（A） 交叉相关图（顶部）和图像PC对，两个完整的轴突，轴突起始段（AIS）相隔9μm，轴突相隔2μm。（B） 如（A）所示，但AIS相隔27μm，轴突相隔24μm。（C） 如（A）所示，但有两个轴突被切断。（D） 切断和完整轴突的同步活动总结。误差线为S.E.M.（0，1.07±0.01；2，1.38±0.05）。未配对t检验（*P<0.05）（E）同步活动是轴突间最小距离的函数。线性回归（红线，R2=0.31). （F） 将同步活动绘制为AIS之间距离的函数（距躯体10μm）。线性回归（红线，R2=0.80).
图8。
图8.通过头波耦合在两台PC之间同步发射的模型
（A） 左：PC1→PC2。（1）动作电位使AIS附近细胞外电位从PC1发生变化。（2） PC1细胞外电压的巨大变化通过脑传播影响附近的PC2。（3） 从PC2打开AIS中的钠通道。（4） 阈下去极化促进同步活动。通过单向相互作用计算0.5 ms延迟的交叉相关图的单峰。右：PC2→PC1。与PC1→PC2相同。通过头视耦合的双向交互计算两个峰值的交叉相关图，延迟±0.5 ms。（B）急性分离PC中以5 mV步长诱发的瞬态钠电流的电压依赖性（改编自Carter和Bean 2012，用于说明目的）。（C） 在切片中记录PC的自发活动，包括−50 mV的红线，以便比较PC的电位作为时间的函数和快速去极化可以打开Na通道的电位（a）。
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