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.2017年9月11日；7(1):11168.
doi:10.1038/s41598-017-11049-8。

新型尿毒症毒素D-丝氨酸通过GCN2激活诱导人肾小管细胞衰老

冈田昭惠 1, Masaomi Nangaku公司 2, 子明饶 三, 前川浩史 1, Yu Ishimono（石原宇） 1, 川上隆 1, 稻井丽子 4
附属公司

新型尿毒症毒素D-丝氨酸通过GCN2激活诱导人肾小管细胞衰老

冈田明等人。 科学代表. .

摘要

慢性肾脏病（CKD）的发病率因社会老龄化而增加，其特征是进行性肾功能不全伴肾小管间质纤维化。肾功能不全期间积聚的尿毒症毒素会导致肾脏损伤，导致肾脏恶化。最近的代谢组学分析表明，CKD患者血浆D-丝氨酸的积累与肾功能障碍的快速进展有关。然而，因果关系和潜在机制仍不清楚。在此，我们证明D-丝氨酸显著诱导人近端肾小管细胞系HK-2和人肾小管原代培养细胞的细胞衰老和凋亡。前者伴有G2/M细胞周期阻滞和衰老相关分泌表型，包括促纤维化和促炎症因子，导致肾小管间质纤维化。由一般对照组不可再抑制2介导的综合应激反应在D-丝氨酸诱导的肾小管细胞毒性和促纤维化表型中起着重要作用，加速CKD进展和肾脏衰老。D-丝氨酸上调L-丝氨酸合成途径。此外，L-丝氨酸给药改善了D-丝氨酸诱导的管状细胞增殖抑制，表明D-丝碱暴露诱导管状细胞中的L-丝氨酸生成状态，并通过L-丝氨酸合成进行补偿。因此，本研究揭示了D-丝氨酸诱导的肾小管损伤和促纤维化表型的分子机制，表明D-丝氨酸是一种参与CKD发病机制的尿毒症毒素。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
丝氨酸抑制人肾小管细胞的细胞增殖并诱导凋亡。(A类)与对照培养基相比，D-丝氨酸培养基在24小时和48小时时显著抑制增殖。细胞数用相对数表示，与Muse计数和存活率试剂盒测量的第-1天的细胞数相比，该试剂盒含有荧光染料，可以区分活细胞和死细胞。每个条形代表对照、20 mM D-丝氨酸处理或20 mM L-丝氨酸处理培养物的平均值（n=6）。在左图中，与未经处理的对照细胞相比，**P<0.01，***P<0.001。†††与D-丝氨酸处理细胞相比，P<0.001。(B类——天)在10和20 mM时，D-丝氨酸显著降低细胞活力(B类). 在D-丝氨酸浓度为20 mM时，HK-2细胞和正常人肾上皮细胞（NHREC）的细胞活力均降低(C类,天). HK-2细胞(B类,C类)或NHREC(天)用1–20 mM的L-或D-丝氨酸处理(B类)或20 mM(C类,天). 使用MTS评估生存能力（每个治疗组4种培养物）。(E类)与对照细胞和用20mM L-丝氨酸处理的细胞相比，用20mM D-丝氨酸处理48小时的HK-2细胞显示膜联蛋白V染色显著增加。如Annexin-V结合和7-氨基放线菌素D（7-AAD）染色所示，D-丝氨酸诱导HK-2细胞凋亡（n=3个培养物/治疗组）。(F类)D-丝氨酸而非L-丝氨酸增加了caspase 3/7的活性（n=3个培养物/治疗组）。(G公司,H（H）)促凋亡基因表达增加行李和彪马在HK-2细胞中(G公司)和NHREC(H（H）)，并降低抗凋亡基因的表达BCL-2型在NHREC中(H（H）)用D-丝氨酸处理48小时（n=6个培养物/治疗组）。(我)用D-丙氨酸或D-脯氨酸在1–20 mM的浓度下处理HK-2细胞48小时，并使用MTS评估生存能力，添加任何一种氨基酸均无显著变化（每个治疗组4个培养物）*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。所有数据均表示为平均值±SEM。
图2
图2
丝氨酸诱导细胞周期阻滞在G2/M期。(A类)用L-或D-丝氨酸处理48小时后通过PI染色进行的细胞周期分析表明，D-丝碱在G2/M诱导细胞周期停滞（每个治疗组3次培养）。(B类)磷酸化组蛋白H3（pH3）免疫荧光染色的代表性图像。丝氨酸增加了pH3阳性的HK-2细胞。量化在缺乏或存在20 mM D-丝氨酸的情况下pH3阳性细胞的百分比（n=每个治疗组随机选择的7个区域）。(C类,天)上调第21页在HK-2细胞中(C类)和NHREC(天)根据qRT-PCR测定，用20 mM D-丝氨酸处理48小时（每个治疗组6个培养物）。(E类)p21表达的Western blot。在HK-2细胞的蛋白水平上证实p21的表达增加（n=3个培养物/治疗组）。给出了典型图像和密度分析*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。所有数据均表示为平均值±SEM。
图3
图3
丝氨酸通过衰老相关分泌表型（SASP）诱导肾小管衰老。(A类,B类)上调第16页HK-2细胞的基因表达(A类)和NHREC(B类)用20 mM D-丝氨酸处理48小时（每组6个培养物）。(C类)对照和D-丝氨酸处理的NHREC的SA-βgal染色的代表性图片和定量评估。D-丝氨酸增加了SA-β-半乳糖染色的NHREC阳性（n=7个区域，每个治疗组随机选择）。(天)对照组和D-丝氨酸处理的HK-2细胞的γ-H2AX免疫荧光染色的代表性图片和定量评估。D-丝氨酸增加了γ-H2AX染色阳性的HK-2细胞（n=每个治疗组随机选择的7个区域）。(E类,F类)促炎细胞因子的表达水平，白介素-6和趋化因子，白介素-8，两个SASP标记在HK-2细胞中上调(E类)和NHREC(F类)20 mM D-丝氨酸处理48小时（每组6个培养物）。(G公司,H（H）)丝氨酸也能诱导IL-6的分泌(G公司)和IL-8(H（H）)化学发光酶联免疫吸附试验（ELISA）测定的培养基中(G公司，n=每组3个培养物）和均匀时间分辨荧光（HTRF）(H（H），n=每组3个培养物）**P<0.01，***P<0.001。所有数据均表示为平均值±SEM。
图4
图4
D-丝氨酸通过GCN2激活作为一种综合应激反应诱导肾小管细胞衰老。(A类)D-丝氨酸（20 mM，48 h）使HK-2细胞中的GCN2磷酸化。(B类)丝氨酸也上调了ISR信号分子，自动变速箱4和CHOP公司，在HK-2细胞中（每个治疗组6个培养物）。(C类)与对照和L-丝氨酸处理的HK-2细胞相比，D-丝氨酸暴露增加了CHOP蛋白的表达。(天)D-丝氨酸暴露（20 mM，48 h）上调NHREC中ISR相关分子（每组6个培养物）。(E类)Western blotting分析显示D-丝氨酸处理的HK-2细胞中PERK、磷酸化PERK（pPERK）或裂解ATF6α的表达没有变化。尤其是ATF4的上游分子pPERK在D-丝氨酸处理后没有显著增加（每个处理组4个培养物）。(F类)siRNA-介导的GCN2敲除诱导通用条款2在HK-2细胞转染48小时后下调约50%（n=4个培养物/治疗组）。(G公司)siRNA-介导的GCN2基因敲除抑制了自动变速箱4,白介素-6，以及白介素-8在D丝氨酸处理的HK-2细胞中（每个治疗组4个培养物）。(H（H）)siRNA-介导的CHOP敲除诱导CHOP公司在HK-2细胞转染48小时后下调约40%（n=4个培养物/治疗组）。(我)siRNA-介导的CHOP敲除通过MTS改善HK-2细胞的细胞增殖障碍（每个治疗组4个培养物）*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。所有数据均表示为平均值±SEM。
图5
图5
丝氨酸激活L-丝氨酸合成途径，D-丝氨酸诱导的肾小管毒性被D-丝碱介质中的L-丝氨酸浓度所改变。(A类)由葡萄糖合成L-丝氨酸的途径，具有重要的酶。G6P；6-磷酸葡萄糖（F6P）；6-磷酸果糖，1,3PBG；1,3-二磷酸甘油，3-PG；3-磷酸甘油酸、谷胱甘肽；谷胱甘肽。(B类)D-丝氨酸（20 mM，48 h）在HK-2细胞的mRNA水平上调了参与L-丝氨酸合成途径的酶的表达（n=6个培养物/治疗组）。(C类)20 mM D-丝氨酸增加了葡萄糖消耗（n=3个培养物/治疗组）。(天)siRNA-介导的ATF4敲除诱导自动变速箱4转染HK-2细胞48小时后下调约60%。siRNA-介导的ATF4敲除抑制PHGDH公司和PSAT1型在D丝氨酸处理的HK-2细胞中（每个治疗组4个培养物）。(E类)L-丝氨酸（1 mM）完全逆转了20 mM D-丝氨酸诱导的HK-2细胞活性降低，而L-丙氨酸或L-脯氨酸则没有（n=4个培养物/治疗组）。(F类,G公司)L-丝氨酸（1 mM）完全逆转了第21页,CHOP公司，以及白介素-820 mM D-丝氨酸对HK-2细胞的诱导作用(F类)和NHREC(G公司)（n=4个培养物/治疗组）。(H（H）)MTS分析显示，与使用正常培养基（L-丝氨酸0.25 mM）相比，在HK-2细胞中使用无L-丝氨酸培养基时，D-丝氨酸诱导的细胞毒性（20 mM）增强（每个治疗组4个培养基）。†††与对照细胞相比，P<0.001。(我)D-丝氨酸细胞毒性随着添加到含有20mM D-丝氨酸的培养基中的L-丝氨酸的减少而成比例增加（每个处理组n=4个培养物）。†与对照细胞相比P<0.05，†††与对照细胞相比，P<0.001*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。所有数据均表示为平均值±SEM。
图6
图6
丝氨酸通过激活GCN2介导的ISR加速CKD。高浓度的D-丝氨酸激活GCN2介导的ISR，ISR上调ATF4和CHOP，导致细胞周期阻滞和凋亡。肾小管细胞衰老、SASP和凋亡导致CKD进展。随着CKD严重程度的加重，血浆D-丝氨酸浓度升高，形成了D-丝碱毒性逐渐加重和肾功能衰竭的恶性循环。另一方面，ATF4上调L-丝氨酸合成反应，这可能部分有助于改善“伪”L-丝氨酸饥饿状态。一直以来，补充L-丝氨酸可以消除D-丝氨酸诱导的细胞毒性。
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