ABT-737 Synergizes with Cisplatin Bypassing Aberration of Apoptotic Pathway in Non-small Cell Lung Cancer

doi:10.1016/j.neo.2017.02.008

.2017年4月；19(4):354-363.

doi:10.1016/j.neo.2017.02.008。 Epub 2017年3月17日。

ABT-737与顺铂协同作用——非小细胞肺癌细胞凋亡途径的旁路异常

金永英（Eun Young Kim）¹, 纪业荣（Ji Ye Jung）¹, 阿鲁姆·金², 尹秀昌^三, Se Kyu Kim先生¹

附属公司

¹韩国代表首尔，03722，Seodaemun-gu，50-1 Yonsei-ro，延世大学医学院3（rd）Floor，内科。
²韩国代表首尔06273，江南谷，211-Eonju-ro，江南大学医学院江南分院附属医院8楼，内科。
^三韩国代表首尔06273，江南谷，211-Eonju-ro，江南大学医学院江南分院附属医院8楼，内科。电子地址：yschang@yuhs.ac。

PMID： 28319809
预防性维修识别码： PMC5358954
内政部： 10.1016/j.neo.2017.02.008

ABT-737协同顺铂绕过非小细胞肺癌细胞凋亡途径的畸变

金永英（Eun Young Kim）等。肿瘤形成. 2017年4月.

.2017年4月；19(4):354-363.

doi:10.1016/j.neo.2017.02.008。 Epub 2017年3月17日。

作者

金永英（Eun Young Kim）¹, 纪业荣（Ji Ye Jung）¹, 阿鲁姆·金², 尹秀昌^三, Se Kyu Kim先生¹

附属公司

¹韩国代表首尔，03722，Seodaemun-gu，50-1 Yonsei-ro，延世大学医学院3（rd）Floor，内科。
²韩国代表首尔06273，江南谷，211-Eonju-ro，江南大学医学院江南分院附属医院8楼，内科。
^三韩国代表首尔06273，江南谷，211-Eonju-ro，江南大学医学院江南分院附属医院8楼，内科。电子地址：yschang@yuhs.ac。

PMID： 28319809
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内政部： 10.1016/j.neo.2017.02.008

摘要

非小细胞肺癌（NSCLC）的一个亚型没有药物驱动突变，采用基于铂的细胞毒性化疗进行治疗，但它会因DNA损伤反应而产生耐药性。在这里，我们研究了顺铂激活STAT3对抗凋亡蛋白的影响，以及与顺铂和BH3模拟物ABT-737联合治疗的效果。我们分析了在NSCLC细胞和K-ras突变小鼠模型中与顺铂联合应用时，顺铂与STAT3通路的关系以及ABT-737的作用。采用Chou-Talalay组合指数法评价该组合的协同作用。通过micro-CT评估体内活性。在NSCLC细胞中，顺铂对SRC-JAK2-STAT3的磷酸化具有时间和剂量依赖性，随后抗凋亡分子的表达增加。当评估临床样本中BCL-2蛋白家族成员的表达时，BCL-xL最常过度表达。显性阴性STAT3抑制其表达，表明STAT3介导顺铂介导的抗凋亡分子过度表达。ABT-737取代线粒体中的BCL-xL并诱导BAK齐聚。ABT-737本身具有细胞毒性作用，ABT-737-顺铂联合使用具有较强的协同细胞毒性。在小鼠肺癌模型中，与ABT-737和顺铂联合治疗可导致显著的肿瘤消退。这些发现揭示了临床前模型中ABT-737和顺铂联合治疗的协同细胞毒性和抗肿瘤活性，并表明使用该策略的临床试验可能对晚期非小细胞肺癌有益。

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数字

图1
顺铂诱导抗凋亡蛋白的过度表达。（A）用10μM和30μM顺铂处理A549和H460细胞24 h，并用免疫印迹法检测抗凋亡分子的表达。（B）用3μM顺铂处理A549和H460细胞1、2、3天，并用免疫印迹法检测抗凋亡分子的表达。（C）用顺铂处理A549和H460细胞6和16小时，用实时PCR检测抗凋亡分子的mRNA表达。（D）使用12名非小细胞肺癌患者的一组富含癌细胞且外观正常的邻近肺组织裂解物，通过免疫印迹法评估抗凋亡分子的表达。所有实验都重复了3次以上，并显示了代表性的图形。肌动蛋白被用作负荷对照，p-H2AX（Ser139）被用作顺铂介导的DNA损伤的标记物。IPO8被用作RT-PCR的内部控制*A549细胞不表达BCL-2(http://www.proteinalas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell/CAB000003). ***P（P）*-与对照组（独立样本）相比，数值小于0.05t吨-测试）。

图2
BCL-xL在非小细胞肺癌中经常过度表达。（A）采用IHC分析BCL-xL在FFPE非小细胞肺癌组织中的表达。采用半定量方法评估BCL-xL的表达，然后将染色分数0、1至3、4至8和≥9分别视为阴性、微量、中度和强表达。表达得分为4分或以上，定义为BCL-xL阳性表达。（B）用IHC分析117例非小细胞肺癌患者BCL-xL的表达。共有88例（75.2%）NSCLC显示BCL-xL阳性表达。（C）根据BCL-xL在117例非小细胞肺癌中的表达情况，使用Kaplan–Meier估计值分析DFS和OS。*P（P）*-值通过对数秩检验获得。

图3
STAT3介导顺铂诱导的抗凋亡分子升高。（A）用指示剂量的顺铂处理A549和H460细胞16 h，并用免疫印迹法评估JNK和SRC的磷酸化。（B）用3μM顺铂处理A549和H460细胞指定时间，并用免疫印迹法评估JNK和SRC的磷酸化。（C）用指定剂量和次数的顺铂处理A549和H460细胞，并用相同的方法进行评估。（D）用JNK组成活性形式（MKK-JNK1）、激酶死亡形式（MK-JNK1（APF））转染A549和H460细胞，并用JNK1-特异性激活剂茴香霉素处理。通过免疫印迹法评估JNK的磷酸化和抗凋亡分子的表达。（E）用顺铂处理A549和H460细胞指定时间，并用免疫印迹法评估SRC、JAK2和STAT3的磷酸化。（F） A549和H1299细胞转染显性阴性形式的STAT3，EF。STAT3DN，并接受或不接受顺铂治疗。免疫印迹法检测抗凋亡分子的表达。（G）用3μM顺铂和/或50 nM SRC抑制剂达沙替尼处理A549和H460细胞16 h。通过免疫印迹法评估p-SRC、pSTAT3和BCL-xL的表达。肌动蛋白被用作负荷对照，p-H2AX（Ser139）被用作顺铂介导的DNA损伤的标记物*A549细胞不表达BCL-2(http://www.proteinalas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell/CAB000003).

图4
BH3模拟物绕过顺铂诱导的抗凋亡分子的升高。（A）用指定剂量的顺铂处理A549和H460细胞1或2小时，然后进行亚细胞分离。（B） BAK、BCL-xL和细胞色素c的免疫荧光染色。用ABT-737处理使线粒体中的BCL-xL移位，并诱导BAK与线粒体标记物MitoTracker共定位。观察到ABT-737处理后细胞色素c释放到细胞质中。线粒体用MitoTracker Red CMXRos（红色）染色，BAK、BCL-xL和细胞色素c用Alexa-488结合二级抗体（绿色）显示。细胞核用DAPI（蓝色）（放大倍率；×630，白色刻度条；10μm）（C）A549细胞进行复染，用顺铂、ABT-737或两种药物联合处理，并进行亚细胞分离。所有实验都重复了3次以上，并显示了代表性的图形。肌动蛋白被用作负荷控制，考克斯IV被用作亚细胞组分的标记物。ctr：对照，cis：顺铂，ABT:ABT-737，combi：联合用药。

图5
顺铂和BH3模拟物的协同作用。（A）用顺铂加或不加ABT-737处理A549和H460细胞48小时，并用免疫印迹法评估细胞死亡。（B）顺铂联合或不联合ABT-737处理A549细胞48 h，Annexin V和PI染色后用流式细胞术评估细胞死亡。（C）直方图表示用1:1固定比例的顺铂与ABT-737处理48小时的A549和H460细胞的细胞死亡%。通过流式细胞仪通过膜联蛋白V-PI染色测量细胞死亡。（D）顺铂和ABT-737处理的A549和H460细胞的F（a）-剂量和F（a-CI曲线。用不同比例的顺铂和ABT-737（1:1、1:0.5和1:2）处理A549和H460细胞48小时，用MTT法测定细胞活力。（E）利用CompuSyn软件估算组合指数，并显示受影响部分（F（a））的组合指数。肌动蛋白被用作负荷对照，p-H2AX（Ser139）被用作顺铂介导的DNA损伤的标记物。所有实验都重复了3次以上，并显示了具有代表性的图形。F（a）：受影响的分数。顺式：顺铂，ABT:ABT-737。

图6
顺铂与ABT-737联合治疗*K-ras公司*突变型肺癌小鼠模型。（A） LSL治疗计划*K-ras公司*G12D小鼠研究。LSL的8周龄杂合子*K-ras公司*G12D小鼠吸入5×10⁷PFU AdenoCre病毒。34±2周时，对小鼠进行显微CT检查，并根据肺部肿瘤的严重程度随机化，然后用溶媒、顺铂、ABT-737或两者联合治疗两周。（B）通过比较治疗前后拍摄的显微CT图像来评估治疗效果。H；心脏，T；肿瘤。（C）瀑布图显示治疗两周后的肿瘤反应。每列代表一个单独的鼠标。*P（P）*-值由Mann–Whitney获得U型测试。（D） H&E染色和激活的caspase-3免疫组化分析治疗小鼠的肺部。对于免疫组织化学，DAB被用作发色基因。（放大倍率；×400，白色比例尺；50μm）。（E）每个高倍视野（×400）的凋亡小体数量以直方图表示。凋亡小体在8个区域进行计数，并由Student进行比较t吨-测试。注：不重要。（F和G）显示了治疗期间小鼠体重的变化。采用单因素方差分析比较治疗2周前后的变化。

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1. Williams J，Lucas PC，Griffith KA，Choi M，Fogoros S，Hu YY，Liu JR。Bcl-xL在卵巢癌中的表达与化疗耐药性和复发性疾病有关。妇科肿瘤。2005;96:287–295.-公共医学
1. Michaud WA、Nichols AC、Mroz EA、Faquin WC、Clark JR、Begum S、Westra WH、Wada H、Busse PM、Ellisen LW。Bcl-2阻断顺铂诱导的细胞凋亡，并预测晚期口咽鳞癌放化疗后的不良预后。2009年临床癌症研究；15:1645–1654.-项目管理咨询公司-公共医学
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