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.2016年6月20:7:11776。
doi:10.1038/ncomms11776。

4E-BP3介导mTORC1长时间抑制过程中的翻译控制

筑波吉诺里 1, 汤米·阿兰 2, 布鲁诺·D·丰塞卡 2, 罗伯特·纳登 三, 纳胡姆·索嫩贝尔格 1
附属公司

4E-BP3介导mTORC1长时间抑制过程中的翻译控制

Tsukumo吉诺等人。 国家公社. .

摘要

以mTORC1为靶点是癌症治疗中极具前景的策略。mTORC1活性的抑制导致eIF4E结合蛋白（4E-BP1-3）的快速去磷酸化，并随后抑制mRNA翻译。然而，在长期使用mTOR抑制剂期间，不同的4E-BP如何影响翻译尚不清楚。在这里，我们表明，在体外和体内长时间mTORC1抑制期间，4E-BP3的表达是转录诱导的，而不是4E-BP1或4E-BP2的表达。从机制上讲，我们的数据表明，4E-BP3的表达是由转录因子TFE3通过EIF4EBP3基因启动子中的顺调控元件控制的。CRISPR/Cas9介导的EIF4EBP3基因在人类癌细胞中的破坏减轻了mTOR抑制剂长期治疗引起的翻译和增殖抑制。我们的研究结果表明，4E-BP3是mTORC1的一个重要效应器，是一个可靠的预测性生物标记物，可用于癌症中mTOR靶向药物长期治疗的疗效。

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数字

图1
图1。4E-BP3由mTORC1抑制转录诱导。
(一)用雷帕霉素（10和100 nM）、INK1341（30和100 nM）或PP242（1μM）处理MiaPaCa-2、PANC-1、BON和MCF-7细胞24小时。通过免疫印迹法测定指示蛋白的表达。抗4E-BP1或-4E-BP2抗体检测4E-BP的低磷酸化和高磷酸化形式。(b条)在指定的时间内，用100 nM的INK1341处理MiaPaCa-2、BON和PANC-1细胞。(c（c）)用雷帕霉素（100 nM）、INK1341（100 nM）或PP242（1μM）处理MiaPaCa-2、BON和PANC-1细胞24小时。通过RT-PCR分析测定mRNA表达。(d日)4E-BP实时PCR分析MiaPaCa-2细胞的表达。的表达式4E-BP公司s根据β-肌动蛋白标准化。误差条显示±标准偏差(n个=3). **P（P）<0.01. 采用单因素方差分析（ANOVA）确定统计显著性。(e（电子）)用100 nM的INK1341处理细胞达到指定时间。通过RT-PCR分析测定mRNA表达。(（f）)4E-BP实时PCR分析MiaPaCa-2细胞的表达。的表达式4E-BP公司s根据β-肌动蛋白标准化。误差条显示±标准偏差(n个=3). *P（P）<0.05和**P（P）<0.01. 使用单因素方差分析确定统计显著性。(克,小时)在放线菌素D（5μg ml）存在或不存在的情况下，用100 nM INK1341处理MiaPaCa-2和MCF-7细胞−1)18h后，通过RT-PCR测定mRNA水平(克)或MiaPaCa-2的实时PCR分析(小时). 误差条显示±标准偏差(n个=3). **P（P）<0.01. 使用Student确定统计显著性t吨-测试。(我,j个)用打乱（sh-Scr）、猛禽（sh-Rap）或利克特（sh-Ric）shRNA-lentivirus转导MiaPaCa-2和BON细胞。将等量的蛋白质平行加载到单独的凝胶上，并通过免疫印迹法测定每个蛋白质的表达。箭头表示非特定带(我). 通过实时PCR分析测定mRNA表达(j个). (一–j个)显示了MiaPaCa-2和MCF-7细胞的三个独立实验或BON和PANC-1细胞的两个独立实验的代表性结果。
图2
图2。电子盒的功能是顺式-的元素EIF4EBP3型TFE3激活启动子。
(一)中的顺序（−163到+59）EIF4EBP3型启动子区域。位置+1表示假定转录起始位点（DBTSS）的信息(http://dbtss.hgc.jp)). 蛋白质编码区用红色字符表示。(b条)E-box突变减少EIF4EBP3型启动子活性。E-box序列5′-CAGCTG CACGTG-3′改为5′-GTCCTG GTGGT-3′。将p4E-BP3pro-Luc（−163 to+59）质粒或其E-boxes突变体和pRL-TK报告质粒瞬时转染MiaPaCa-2细胞作为对照。24 h后，用100 nM的INK1341处理细胞24 h。使用双荧光素酶检测试剂盒测量相对荧光素素酶活性。误差条显示±标准偏差(n个=3). **P（P）<0.01. 使用双向方差分析（ANOVA）确定统计显著性。给出了三个独立实验的代表性结果。(c（c）)TFE3型和TFEB公司在三个细胞系中表达。通过RT–PCR分析每个mRNA的表达。(d日)用指定数量的TFE3（HA-tag）质粒瞬时转染MiaPaCa-2细胞。通过免疫印迹法检测蛋白质。给出了两个独立实验的代表性结果。(e（电子）)将指定数量的TFE3（HA-tag）质粒与报告质粒瞬时转染MiaPaCa-2细胞，如b条48小时后，使用双荧光素酶测定试剂盒测量相对荧光素素酶活性。误差条显示±标准偏差(n个=3). **P（P）<0.01. 使用双向方差分析确定统计显著性。给出了三个独立实验的代表性结果。
图3
图3。TFE3介导4E-BP3型.
(一)用100 nM的INK1341处理MiaPaCa-2细胞1 h。固定细胞，用抗TFE3抗体和Alexa-Fluro 488染色细胞内内源性TFE3蛋白。比例尺，10μm。(b条)用100 nM的INK1341处理MiaPaCa-2细胞1小时。用Dounce均质器溶解细胞。通过离心分离细胞核和细胞质部分。蛋白质水平通过免疫印迹法测定。箭头显示磷酸化或去磷酸化的形式（带星号的箭头）。(c（c）)用100 nM的INK1341处理细胞1 hEIF4EBP3型用染色质免疫沉淀法分析启动子。(d日,e（电子）)用打乱（sh-Scr）或TFE3 shRNA（sh-TFE3）转导MiaPaCa-2细胞。蛋白质和mRNA水平分别通过免疫印迹和实时PCR分析测定。mRNA水平根据β-肌动蛋白标准化。误差条显示±标准偏差(n个=3). *P（P）<0.05和**P（P）<0.01. 使用双向方差分析（ANOVA）确定统计学显著性。(（f）)用报告质粒（p4E-BP3pro-Luc（−163至+59）质粒和pRL-TK）瞬时转染表达打乱或TFE3 shRNA的MiaPaCa-2细胞。24 h后，用雷帕霉素（100 nM）、INK1341（100 nM）或PP242（1μM）处理细胞24 h，然后测定相对荧光素酶活性，如b条误差线表示±标准偏差(n个=3). *P（P）<0.05和**P（P）<0.01. 使用双向方差分析确定统计显著性。三个代表性结果(一,b条)或两个独立的实验(c（c）–（f）)如图所示。
图4
图4。4E-BP3限制mTORC1抑制期间cap依赖性翻译。
(一)用mTOR抑制剂（Rapa 100 nM和PP242 1μM）处理MiaPaCa-2细胞指定的时间。裂解液经过m7GDP下拉分析。给出了两个独立实验的代表性结果。(b条)人类外显子1EIF4EBP3型以Crispr-Cas9镍酶系统为目标。目标序列显示为蓝色。原间隔区邻接基序（PAM）以红色突出显示。蛋白质编码区下划线。(c（c）)两种sgRNAs靶向诱导的内部缺失EIF4EBP3型蛋白质编码区下划线。(d日)通过非放射性嘌呤霉素标记法（SUnSET）测定蛋白质合成（见方法）**P（P）<0.01. 使用双向方差分析（ANOVA）确定统计显著性。给出了三个独立实验的代表性结果。(e（电子）)双顺反子报告结构图（顶部）。用双顺反子报告质粒构建物转染MiaPaCa-2细胞24小时，然后用mTOR抑制剂处理12小时。使用双荧光素酶检测试剂盒（Promega）测量每个荧光素素酶活性。误差条显示±标准偏差(n个=3). **P（P）<0.01. 使用双向方差分析确定统计显著性。给出了三个独立实验的代表性结果。
图5
图5。4E-BP3在长时间mTORC1抑制下调节eIF4E靶mRNA的翻译。
(一)4E-BP3 WT和KO MiaPaCa-2细胞中的多聚体分析。用100 nM INK1341处理细胞24小时(b条)通过实时PCR分析重、轻或亚溶体中每种mRNA的丰度。误差条显示±标准偏差(n个=3). *P（P）<0.05和**P（P）<0.01. 使用Student’st吨-测试。(一,b条)给出了两个独立实验的代表性结果。(c（c）)用指示的mTOR抑制剂（Rapa 100 nM、INK1341 100 nM和PP242 1μM）处理4E-BP3 WT或KO MiaPaCa-2细胞24小时。通过免疫印迹法测定每个蛋白的表达。给出了三个独立实验的代表性结果。(d日)用INK1341（100 nM）处理4E-BP3 WT、KO、4E-BP1,2,3 TKO或4E-BP1 KO细胞2或24 h。通过免疫印迹法测定每个蛋白的表达。给出了两个独立实验的代表性结果。(e（电子）)使用ImageJ通过密度分析量化细胞周期蛋白D3蛋白表达，并通过β-肌动蛋白水平进行归一化。误差条显示±标准偏差(n个=3). (（f）)CCND3号机组用实时PCR分析mRNA水平。误差条显示±标准偏差(n个=3). 给出了三个或两个独立实验的代表性结果。
图6
图6。4E-BP3是肿瘤中mTORC1的重要下游效应器。
(一,b条)数据集来自基因表达综合（GEO）数据库网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/geo（注册号GSE37129）。雄性C57BL/6小鼠在2周时注射二乙基亚硝胺（DEN）。44周后，每天给小鼠服用安慰剂、RAD001或BEZ235。(一,b条)每个基因表达的相对变化是通过将药物治疗样品中表达值的平均值除以安慰剂中的表达值平均值来确定的(b条). 采用单因素方差分析（ANOVA）确定统计显著性*P（P）<0.05, **P（P）<0.01. (c（c）)将4E-BP3 WT或KO MiaPaCa-2细胞培养指定的天数。使用BioRad TC10自动细胞计数器自动计算活细胞数。(d日,e（电子）)用mTOR抑制剂处理4E-BP3 WT或KO细胞72小时。比例尺，200μm。使用BioRad TC10自动细胞计数器自动计数活细胞。误差条表示±s.d(n个=3). **P（P）<0.01. (（f）)用mTOR抑制剂处理WT或KO细胞72小时。用BrdU掺入法测量细胞增殖。误差条显示±标准偏差(n个=3). **P（P）<0.01. (克)4E-BP3 WT或KO细胞在单层上生长，10天后通过结晶紫染色确定病灶形成。比例尺，2 mm(小时)使用ImageJ计算大于1 mm的病灶数量。结果表示相对于对照组（设置为100%）±s.d的平均细胞数(n个=3). **P（P）<0.01. 使用双向方差分析确定统计显著性。(c（c）–小时)给出了三个独立实验的代表性结果。(我)数据集来自基因表达综合数据库（GEO），网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/geo（加入号GSE9893）。155例乳腺癌患者总体生存率的Kaplan-Meier分析，按高（红色）和低（蓝色）分层4E-BP3型（对数秩检验P（P）-值<0.0001）。虚线表示95%置信区间。(j个)表达式之间的相关性4E-BP3型以及以下基因：TSC1类,PTEN公司,虚拟专用交换机11,ESRRA公司,ATP5G1型和COX5A公司，在人类乳腺癌组织中（登录号GSE9893）。相关系数采用Spearman系数分析法确定。
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