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.2016年5月16日；36(11):1655-72.
doi:10.128/MCB.01095-15。 打印日期：2016年6月1日。

Nrf2介导的骨骼肌糖原代谢调控

阿基拉·乌鲁诺 1, 横野洋子 2, 加藤富美 三, 北岛康夫 4, 阿基·努诺米亚 5, 长谷龙一 4, 镜泊皮 6, 希亚姆·S·比斯瓦尔 7, 山本正彦 8
附属公司

Nrf2介导的骨骼肌糖原代谢调控

阿基拉·乌鲁诺等人。 分子细胞生物学. .

摘要

Nrf2（NF-E2-related factor 2）有助于维持体内葡萄糖稳态。Nrf2通过保护胰腺β细胞免受氧化应激和提高外周组织葡萄糖利用率来抑制血糖水平。为了阐明Nrf2有助于维持葡萄糖稳态的分子机制，我们制作了骨骼肌（SkM）特异性Keap1基因敲除（Keap1MuKO）小鼠，该小鼠在其SkM中表达丰富的Nrf2，然后检测该组织中Nrf2靶基因的表达。在Keap1MuKO小鼠中，血糖水平显著下调，糖原分支酶（Gbe1）和肌肉型PhKα亚基（Phka1）mRNA的水平，以及糖原分支酶（GBE）和磷酸化酶b激酶α亚基（PhKα）蛋白的水平在小鼠SkM中显著上调。与此结果一致，化学Nrf2诱导剂促进小鼠SkM和C2C12肌管中Gbe1和Phka1 mRNA的表达。染色质免疫沉淀分析表明，Nrf2结合Gbe1和Phka1上游启动子区域。在Keap1MuKO小鼠中，肌肉糖原含量显著降低，强制C2C12肌管中GBE表达促进葡萄糖摄取。因此，我们的结果表明，SkM中Nrf2的诱导增加了GBE和PhKα的表达，降低了肌肉糖原含量，从而提高了葡萄糖耐量。我们的结果还表明，Nrf2对SkM和肝脏中的糖原代谢有不同的调节作用。

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数字

图1
图1
SkM-特异性Nrf2诱导小鼠的葡萄糖代谢。（A） 用ipGTT测量血糖水平和AUCKeap1FB公司/联邦调查局和Keap1MuKO-B公司老鼠(n个=8或9）。禁食16小时后，向9周龄雄性小鼠腹腔注射葡萄糖（2 g/kg体重）。（B） 血糖水平Keap1FB公司/联邦调查局和Keap1MuKO-B公司老鼠要么喂食随意或在禁食条件下(n个= 9). （C） 9周龄男性血浆胰岛素水平Keap1FB公司/联邦调查局和Keap1MuKO-B公司老鼠(n个=8或9）进给随意（D）9周龄男性的体重Keap1FB公司/联邦调查局和Keap1MuKO-B公司老鼠(n个= 9). （E）基亚1SkM和肝脏组织中mRNA的表达Keap1FB公司/联邦调查局和Keap1MuKO-B公司老鼠(n个= 9). 数据被标准化为Hprt（小时）和中的表达式级别Keap1FB型/联邦调查局小鼠设为1只。（F） 用ipGTT测量血糖水平和AUCNrf2F型/F类::Keap1FB公司/联邦调查局和Nrf2F型德尔/F类德尔::Keap1MuKO-B公司老鼠(n个= 7). 禁食16小时后，向9周龄雄性小鼠腹腔注射葡萄糖（2 g/kg体重）。（G） 血糖水平Nrf2F型/F类::Keap1FB公司/联邦调查局和Nrf2F型德尔/F类德尔::Keap1MuKO-B公司老鼠要么喂食随意或在禁食条件下(n个= 7). （H） 9周龄男性的体重Nrf2F型/F类::Keap1FB公司/联邦调查局和Nrf2F型德尔/F类德尔::Keap1MuKO-B公司老鼠(n个= 7). （一）基亚1和编号2SkM中mRNA的表达Nrf2F型/F类::Keap1FB公司/联邦调查局和Nrf2F型德尔/F类德尔::Keap1MuKO-B公司老鼠(n个= 7). 数据标准化为Hprt（小时）和中的表达式级别Nrf2F型/F类::Keap1FB型/联邦调查局小鼠设为1只。误差条显示平均值±SEM。***，P（P）< 0.001; **,P（P）< 0.01; *,P（P）<0.05（与对照组相比）。所有数据均来自ICR背景小鼠。
图2
图2
SkM-特异性Nrf2诱导小鼠的能量消耗。（A） 28岁男性的CT图像Keap1FB公司/联邦调查局和Keap1MuKO-B公司老鼠。注意，这些小鼠的附睾脂肪团几乎是可比的。（B） 用HU在连续切片CT图像中估计全身瘦肉和脂肪体积(n个= 5). （C到E）解剖的SkM的组织重量（C）、耗氧量（D）和线粒体DNA含量（E）(n个= 5). 耗氧量标准化为组织重量（D）。线粒体DNA含量数据被归一化为基因组DNA含量Keap1FB公司/联邦调查局小鼠设为1（E）。误差条显示平均值±SEM。*，P（P）<0.05（与对照组相比）；编号.，不显著。所有数据均来自ICR背景小鼠。
图3
图3
SkM-特异性Nrf2缺失小鼠的葡萄糖代谢。（A） 通过ipGTT测量的血糖水平和AUCNrf2F型/F类和Nrf2MuKO公司老鼠(n个= 6). 禁食16小时后，对8周龄雄性小鼠腹腔注射葡萄糖（2 g/kg体重）。（B） 血糖水平Nrf2F型/F类和Nrf2MuKO型老鼠要么喂食随意或在禁食条件下(n个= 6). （C） 的体重Nrf2F型/F类和Nrf2MuKO公司老鼠(n个= 6). 误差条显示平均值±SEM。**，P（P）< 0.01; *,P（P）<0.05（与Nrf2F型/F类老鼠）。所有数据均来自C57BL/6J背景小鼠。
图4
图4
Nrf2调节糖原代谢相关酶的表达。（A）千兆比特,Phka1号机组、和编号19周龄男性SkM mRNA表达水平Keap1FB公司/联邦调查局,Keap1MuKO-B公司,Nrf2F型/F类::Keap1FB公司/联邦调查局、和Nrf2F型德尔/F类德尔::Keap1MuKO-B公司老鼠(n个=6至9）。（B）基亚1,千兆比特,Phka1型、和编号19周龄男性SkM mRNA表达水平Keap1FA公司/+,Keap1FA公司/FA公司、和Keap1MuKO-A公司老鼠(n个= 6). （C）编号2,千兆比特1,Phka1号机组、和编号16周龄男性SkM的mRNA表达水平Nrf2F型/F类和Nrf2MuKO公司老鼠(n个= 4). 数据标准化为Hprt（小时），每个对照中的表达水平设置为1。9周龄雄性大鼠骨骼肌中GBE、PhKα1、NQO1和α-微管蛋白（TUB）的（D，E）免疫印迹分析Keap1FB公司/联邦调查局和Keap1MuKO-B公司老鼠(n个=6）（D）和6周龄Nrf2F型/F类和Nrf2MuKO公司老鼠(n个=6或7）（E）。蛋白质表达被量化并归一化为TUB。每个对照中的表达水平设置为1。误差条显示平均值±SEM。***，P（P）< 0.001; **,P（P）< 0.01; *,P（P）<0.05（与对照组相比）。所有数据均来自ICR背景小鼠。
图5
图5
Nrf2调节SkM糖原代谢。（A） 用于评估SkM糖原代谢的方案。（B） SkM的糖原含量Keap1FB公司/联邦调查局禁食小鼠(n个=4）和F/R条件(n个=6）和Keap1MuKO-B公司F/R条件下的小鼠(n个= 6); 将数据归一化为组织重量。（C） 糖原磷酸化酶介导的G1P从来自Keap1FB公司/联邦调查局和Keap1MuKO-B公司F/R条件下的小鼠(n个= 6). 牡蛎糖原作为阳性对照；数据以任意单位（AU）表示一340（左侧），根据一34030分钟内每毫克糖原（右侧）。误差条显示平均值±SEM。***，P（P）<0.001（与对照组相比）。所有数据均来自ICR背景小鼠。
图6
图6
肝脏中的Nrf2和糖原代谢。（A和B）基亚1,编号1、和千兆比特15周龄男性肝脏mRNA表达谱Keap1FB公司/联邦调查局和Keap1LKO-B公司小鼠（A；n个=6）和Keap1FA公司/+,Keap1脂肪酸/FA公司、和Keap1LKO-A公司小鼠（B；n个= 6). 数据标准化为Gapdh公司，并且对照组中的表达水平设置为1。（C） 肝糖原代谢评估方案。（D和E）Keap1FB公司/联邦调查局禁食小鼠(n个=3）和F/R条件(n个=8），英寸Keap1MuKO-B公司F/R条件下的小鼠(n个=8），英寸Keap1FA公司/+禁食和F/R条件下的小鼠，以及Keap1MuKO-A公司F/R条件下的小鼠(n个= 6). 糖原含量标准化为组织重量。（F） 血糖水平Keap1LKO-B公司和Keap1FB公司/联邦调查局老鼠(n个=10或11），通过ipGTT测量。禁食16小时后，向9周龄雄性小鼠腹腔注射葡萄糖（2 g/kg体重）。误差条显示平均值±SEM。***，P（P）< 0.001; ***,P（P）< 0.01; *,P（P）< 0.05.编号.，不显著。所有数据均来自ICR背景小鼠。
图7
图7
化学Nrf2诱导对千兆比特和Phka1号机组表达。（A） Nrf2诱导化学品对千兆比特,Phka1型、和编号1基因表达。用0.1%二甲基亚砜（载体[Veh]）、100μmol/L DEM、50μmol/L tBHQ、10μmol/l SFN或100 nmol/L CDDO-Im处理C2C12肌管24小时。数据标准化为Hprt公司，车辆处理细胞的表达水平设为1(n个=4个）。（B） 剂量反应分析。用0.1%二甲基亚砜（0剂量载体）或CDDO-Im处理C2C12肌管24小时。数据标准化为Hprt（小时），载体处理组的表达水平设为1(n个=4个）。（C） 时间进程分析。在指定的时间内，用0.1%二甲基亚砜或100 nmol/L CDDO-Im处理C2C12肌管。数据标准化为Hprt（小时），时间零点组中的表达水平设置为1(n个=4个）。误差条显示平均值±SEM。***，P（P）< 0.001; *,P（P）<0.05（与对照组相比）。
图8
图8
CDDO-Im对千兆比特和体内Phka1（A，B）CDDO-Im给药对小鼠SkM（A）和肝脏（B）影响的时间进程分析。野生型（WT）和编号2敲除小鼠口服CDDO-Im（30μmol/kg体重）或溶媒，并在指定时间收集SkM和肝脏(n个分别为3和6小时，n个=4，持续12小时）。首次给药6小时后，将CDDO-Im（30μmol/kg体重）和载体重新给药至12小时组。数据标准化为Hprt（小时），并且将载体处理的野生型小鼠中的表达水平设定为1。误差条显示平均值±SEM。***，P（P）< 0.001; **,P（P）<0.01（与车辆处理野生型相比）。所有数据均来自C57BL/6J背景小鼠。
图9
图9
Nrf2诱导对运动能力的影响。（A和B）CDDO-Im给药方案（A）和跑步机测试（B），以评估运动能力。（C） CDDO-Im或载体治疗后8周龄雄性小鼠的跑步机试验结果(n个=6或7）。确定了最大运行速度和距离。（D） 跑步机测试后的血糖水平(n个=6或7）。（E至G）SkM组织重量（E）；SkM和肝脏糖原含量（F）；和表达水平千兆比特,Phka1号机组、和编号1在跑步机运动前和运动后1天的SkM（G）(n个=6或7）。将糖原含量归一化为组织重量（F）。mRNA数据标准化为Hprt公司，并且车辆处理的预处理小鼠的表达水平设置为1。误差条显示平均值±SEM。***，P（P）< 0.001; **,P（P）< 0.01; *,P（P）<0.05（与车辆处理小鼠相比）。所有数据都是从C57BL/6J背景小鼠中收集的。
图10
图10
Nrf2转录调控千兆比特和Phka1号机组表达。（A） ChIP-seq配置文件的屏幕截图千兆比特和编号1来自CDDO-Im（100 nmol/L，3 h）处理C2C12肌管和抗Nrf2抗体的两个独立实验（实验）的TSS。（B） 手动ChIP分析千兆比特（来自TSS的kb−0.4和kb+15）和编号1（一个积极的轨迹）。用抗Nrf2抗体免疫沉淀Nrf2-DNA复合物(n个=4）或对照IgG(n个=3）从用0.1%二甲基亚砜或100 nmol/L CDDO-Im培养3 h的C2C12肌管的核提取物中提取。数据是输入DNA的百分比。（C） 在0.1%二甲基亚砜或100 nmol/L CDDO-Im中培养3小时的C2C12肌管核提取物中Nrf2和层粘连蛋白B的免疫印迹分析（D）包含小鼠5′-侧翼区域的嵌合报告子示意图千兆比特基因和荧光素酶cDNA。SV40，猴病毒40。C2C12成肌细胞中的（E和F）荧光素酶报告子分析。用报告载体瞬时转染C2C12成肌细胞，并培养24小时，以显示CDDO-Im的浓度。响应不同剂量CDDO-Im（E）的萤光素酶报告基因表达的分析和千兆比特ARE（F）。剂量0（E，0.1%二甲基亚砜载体）和载体处理野生型报告子（F）的转录活性设置为1(n个= 4). 数据是相对萤火虫荧光素酶活性（测试）归一化为Renilla荧光素酶活性（对照）。（G） 手动ChIP分析Phka1型用0.1%二甲基亚砜或100 nmol/L CDDO-Im与抗Nrf2抗体培养3 h的C2C12肌管核提取物中的（来自TSS的kb−1.6）(n个=4）或对照IgG(n个= 3). 数据是输入DNA的百分比。误差条显示平均值±SEM。***，P（P）<0.001（相对于车辆）。
图11
图11
Nrf2增强SkM的葡萄糖摄取。（A） 8周龄雄性大鼠的2DG摄取Keap1FA公司/+和Keap1FA公司/-小鼠4小时。禁食16小时后，腹腔注射2-DG（1 g/kg体重）。数据是细胞内2-DG–6-磷酸水平与组织重量的标准化(n个=7），控制中的液位设置为1。（B） 的配置文件Keap1FA公司/–::Nrf2MuKO公司老鼠。（C） 糖尿病患者ipGTT中的血糖水平和AUCKeap1FA公司/+::Nrf2F型/F类,Keap1FA公司/–::Nrf2F型/F类、和Keap1脂肪酸/–::Nrf2MuKO公司老鼠(n个=5或6）。16周龄雄性小鼠在禁食16小时后腹腔注射葡萄糖（2 g/kg体重）。（D）千兆比特和Phka1型SkM的mRNA表达水平(n个=5或6）。数据被标准化为Hprt（小时），并且对照组中的表达水平设置为1。误差条显示平均值±SEM。***，P（P）< 0.001; *,P（P）<0.05（与对照组相比）。†，P（P）<0.001（与Keap1FA公司/–::Nrf2F型/F类老鼠）。所有数据均来自ICR背景小鼠。
图12
图12
SkM-特异性诱导Nrf2可改善糖尿病。8-9周龄对照组的血糖水平（A）和体重（B）数据库/数据库::Keap1FA公司/FA公司(n个= 9; 所有女性）和数据库/数据库::Keap1MuKO-A公司(n个= 5; 喂食4只雌性和1只雄性小鼠随意如图所示。误差条显示平均值±SEM。*，P（P）<0.05（与对照组相比）。所有数据均来自ICR背景小鼠。
图13
图13
肝脏、SkM糖原和葡萄糖代谢的Nrf2调节示意图。Nrf2介导的GBE和PhKα1诱导加速了SkM糖原的分支和分解。在SkM中，Nrf2增强G1P的糖原释放，促进葡萄糖摄取、运动能力和运动能力。相反，Nrf2增强了肝脏中GBE而非PhKα1的表达，促进糖原储存，并有助于在禁食期间维持血糖水平。
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