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.2015年12月；18（12）：1819-31。
doi:10.1038/nn.4160。 Epub 2015年11月2日。

细胞类型和脑区分辨的小鼠脑蛋白质组

柯蒂·夏尔马 1, 塞巴斯蒂安·施密特 2 三, 卡罗琳·G·伯格纳 2 三, 斯特凡卡·泰亚诺娃 1, 尼马尔·坎奈扬 4, 娜塔莉亚·曼里克·霍约斯 2 三, 卡琳娜·孔吉 5, 卢多维科·坎图蒂 2 三, Uwe-Karsten Hanisch公司 6, 玛丽安·菲利普斯 5, 莫里茨·罗斯纳 2 4, 马蒂亚斯·曼 1, 米凯尔·西蒙斯 2 三
附属公司

细胞类型和脑区分辨的小鼠脑蛋白质组

柯蒂·夏尔马等。 自然神经科学. 2015年12月.

摘要

大脑转录组和连接组图谱正在生成中，但目前缺乏对蛋白质组的同等研究。我们进行了基于高分辨率质谱的蛋白质组学，以深入分析小鼠大脑及其主要脑区和细胞类型。将少突胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和皮层神经元中12934种已鉴定的蛋白质与转录组的深度测序数据进行比较，表明蛋白质组的覆盖范围很广。被定义为比平均表达量多10倍的细胞类型特异性蛋白质约占蛋白质组的十分之一，细胞表面蛋白质过度表达。为了证明我们的资源的实用性，我们将重点放在这类蛋白质上，并将IgLON家族的粘附分子Lsamp鉴定为髓鞘形成的负调控因子。我们的发现为系统级理解中枢神经系统细胞类型多样性提供了框架，并为大脑发育和功能分析提供了丰富的资源。

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竞争性财务利益

作者声明没有竞争性的经济利益。

重印和权限信息可在线获取，网址为http://www.nature.com/reprints/index.html.

数字

图1
图1。蛋白质组和RNA-Seq数据的比较。
（a）细胞类型和脑结构解析小鼠脑蛋白质组的工作流程图解。DIV，天体外试验。 （b）一个条形图，显示成年小鼠大脑和每种培养细胞类型中鉴定的蛋白质数量，当分析为6x SAX组分时，FDR为1%。小脑颗粒神经元。（c）在所有细胞类型和大脑中总共鉴定出10529个蛋白质（约占所有鉴定蛋白质的84%），至少两个蛋白质组之间平均分享约99%的蛋白质鉴定。（d）小鼠大脑、不同大脑结构和小脑发育的单次运行分析；4个生物重复（视神经和胼胝体重复3次）通过单次4h LC-MS/MS运行进行测量。在MaxQuant环境中，将分馏大脑和细胞型蛋白质组的运行进行匹配后，显示已识别的蛋白质数量。（e）培养细胞的RNA-Seq分析和由此产生的基因表达水平的密度图。如图所示，显示了每种细胞类型和所有细胞类型组合的基因表达水平的密度估计值。通过提取所有细胞类型中的最大表达值，得出组合细胞类型。在所有细胞类型中，基因表达水平遵循二项分布（黑色）。为RPKM>1值过滤的基因表达式以蓝色显示。（f）mRNA水平和蛋白质水平上表达基因数量的文氏图。
图2
图2。细胞蛋白质组的比较分析。
（a）162个相关图的矩阵显示，LFQ强度之间存在非常高的三倍相关性（不同细胞类型之间的皮尔逊相关系数为0.94–0.98）。颜色代码遵循相关系数的指示值。（b）PCE公司。所有细胞类型的蛋白质组及其分化状态按组分1和组分2分为三份，分别占变异的44.7%和14.3%。（c）iBAQ强度（蛋白质组）与RPKM值（转录组）的相关图。颜色遵循相关系数的指示值。（d）标记蛋白在单个重复中的折叠表达如日志所示2与其他单元格类型相比，以指定单元格类型中的平均值作为点进行缩放。（e）不同细胞类型间差异表达的蛋白质热图（每种细胞类型n=3）。显示了为集群丰富的顶级类别。在无监督的层次聚类后，显著差异表达蛋白质的z评分LFQ强度的热图。蛋白质被分为四个簇，显示经过Fisher精确测试后丰富的顶级类别注释(P（P）═0.02).
图3
图3。表达基因的定量分析。
（a）特定GO注释项的分析（条形图上方以红色表示）显示为与注释项对应的基因百分比和归因于这些注释的蛋白质质量百分比。对指定细胞类型中鉴定的所有蛋白质或指定细胞类型特有的蛋白质分别进行分析。（b）所示细胞类型的蛋白质丰度从最高到最低的累积蛋白质质量。该表列出了构成不同分位数的蛋白质总数（Q1-Q4）以及显示细胞类型特异性表达的这些蛋白质的百分比。（c、d）急性分离细胞与培养细胞的比较。（c）使用MACS微球与寡突胶质细胞04抗体、神经元祖细胞PSA-NCAM抗体、小胶质细胞CD11b抗体和星形胶质细胞ACSA-2抗体分离细胞。热图显示了急性分离细胞和培养细胞类型之间的皮尔逊相关系数。色码表示相关系数的值。（d）图中显示了GOCC蛋白质富集度>10倍的图日志10 P（P）该值是根据GOCC项的富集因子绘制的。
图4
图4。小鼠大脑及其细胞类型中含有丰富的蛋白质。
（a）原木散点图2fold表达式与log2与小鼠肝脏蛋白质组相比，成年小鼠大脑中的LFQ强度。在成年小鼠大脑中最丰富和富集的前40种蛋白质中，有髓鞘（红色）、细胞骨架（蓝色）和突触（绿色）的蛋白质。（b）原木散点图2fold表达式与log2与其他细胞类型相比，所示细胞类型的LFQ强度突出已知和先前未知的细胞类型特异性标记。
图5
图5。脑区分辨蛋白质组
（a）PCA。小鼠主要脑区（P60）的蛋白质组分为四份（视神经和胼胝体为三份），并根据组分1和组分2进行分离，分别占变异性的34.8%和24.5%。（b）不同脑区蛋白质差异表达的热图。热图基于在无监督的层次聚类后显著差异表达蛋白质的z评分LFQ强度。显示了表达差异超过四倍的蛋白质。（c）原木散点图2折叠表达式与对数2与其他脑区相比，指定脑区前20个蛋白质的LFQ强度。较大的红色圆圈表示选择的蛋白质与分析的相应转录物进行比较就地艾伦脑图谱项目中的杂交。图片取自艾伦大脑图谱(http://mouse.brain-map.org). 图片来源：艾伦脑科学研究所。（d）图中显示了GOCC富集蛋白质>10倍的富集图-日志10 P（P）该值根据GOCC项的富集因子绘制。
图6
图6。比较通路富集分析确定寡突胶质细胞和神经元中富集的细胞粘附分子。
（a）根据一维注释测试（在线方法）的得分差异进行聚类后，KEGG通路在不同细胞类型中的注释矩阵显示为热图（红色表示KEGG途径丰度较高，蓝色表示丰度较低）。（b）寡核细胞与神经元中KEGG途径细胞粘附分子（CAM）对应的蛋白质LFQ强度散点图。（c）对于不同CNS细胞类型中的IgLON家族蛋白，单个三倍体的无标签定量显示为平均值±标准偏差的点。（d）原木散点图2fold表达式与log2大脑和肝脏中与KEGG途径细胞粘附分子相对应的蛋白质的z标准化蛋白强度。
图7
图7。Lsamp与少突胶质细胞和神经元相互作用并在其上表达。
（a）Lsamp-Fc与βMI微管蛋白抗体标记的神经元的结合。Necl4-Fc为阳性对照，Necl1-Fc为阴性对照。用Cy3-偶联抗Fc抗体观察Fc片段。（b）Lsamp-Fc与用MBP抗体标记的少突胶质细胞的结合。Necl 1-Fc为阳性对照，Necl4-Fc为阴性对照。（c）Lsamp-Fc不与标记有Gfap抗体的星形胶质细胞结合。（d）含有所示蛋白胞外结构域的分泌型Fc融合蛋白的免疫印迹。（e）混合胶质细胞培养物的免疫荧光显示寡突胶质细胞（O1；品红色）染色，而星形胶质细胞（Gfap；绿色）不显示抗Lsamp抗体（红色）。（f）上图，Lsamp存在于神经元亚群（神经丝200 kDa）（右上图）。箭头表示Lsamp阳性神经元过程，箭头表示Lsamp阴性过程。底部，Lsamp在小胶质细胞（Iba1）中不存在，如混合神经胶质培养物染色所示。（g）野生型小鼠的脑切片在P10处用抗Lsamp（红色）抗体进行免疫染色，在P30处用Lsamp和MBP（绿色）抗体进行染色。Lsamp染色在P10处沿着伞和前连合（AC）的轴突束富集，而在P30处不富集。比例尺代表10μm。
图8
图8。Lsamp是伞纤维束髓鞘形成的负调节因子。
（a）对照组（野生型，WT）和Lsamp敲除（KO）小鼠在P30和P60时的菌毛/穹隆的电子显微镜图像。比例尺表示1|μm（b）对照组（黑色）和Lsamp KO小鼠（品红色）P20、P30和P60处伞/穹隆单个纤维的g比率散点图。（c）直方图显示野生型和Lsamp KO小鼠P20、P30和P60处有髓轴突相对于轴突直径的百分比，间隔0.3μm。与对照组相比，突变体中低口径轴突的髓鞘化发生了转变（纸样检验；从上到下：P（P）═ 4.5 x 10-10,P（P）═ 2.8 x 10-5,P（P）═ 0.36，***P<0.0001）。每个基因型的轴突计数超过~250个（每个基因型三只动物）（d）野生型和Lsamp KO小鼠P20、P30和P60的平均g比率（Student’st吨测试，P（P）═ 0.0105;n个═ 每个基因型3只小鼠）。误差线代表s.d。（e）P20、P30和P60处有髓和无髓轴突的百分比。对于每个时间点，计数超过1500个轴突（P20和P30的5只小鼠，n个═ P60为4）（条形图显示平均值±标准差；Student t检验；**P≈0.0055，***P≈0006）。（f，g）盖玻片涂有10μg ml-1Fc融合蛋白（IgLON家族蛋白和对照）和少突胶质前体细胞被镀上，并允许其粘附和生长4天。PLL和Necl1-Fc涂层被用作阳性对照。用空载体（pcDNA）转染HEK 293T细胞的纯化上清液作为阴性对照（bars显示平均值±s.d.；ANOVA，P（P）⋖0.05，邓内事后（post-hoc）以pcDNA为对照进行检测；n个═ 3个实验*P∈0.0087，**P∈0.0025）。比例尺代表20μm。
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