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.2015年9月8日；12(10):1704-14.
doi:10.1016/j.celrep.2015.08.005。 Epub 2015年8月28日。

CTCF通过异常CTCF结合位点将着丝粒蛋白CENP-E招募到染色体的着丝粒周围/着丝粒区域

挑江晓 1, Patompon Wongtrakoongate公司 2, Cecelia Trainor公司 1, 加里·费尔森菲尔德 三
附属公司

CTCF通过不寻常的CTCF结合位点将着丝粒蛋白CENP-E募集到染色体的着丝粒周围/着丝粒区域

挑江晓等。 单元格代表. .

摘要

CTCF在稳定染色质位点之间维持核结构所必需的长程相互作用方面的作用已经得到了很好的证实。这些相互作用大多涉及通过CTCF将凝集素复合体募集到染色质。我们发现CTCF在体外和体内也与着丝粒蛋白CENP-E相互作用。我们在着丝粒/着丝粒DNA中确定了CTCF位点，发现在有丝分裂早期，CTCF与这些位点结合并招募CENP-E。与大多数已知的CTCF基因组位点不同，CTCF着丝粒/着丝粒区域中的结合位点与CTCF的C末端指强烈相互作用。靶向这些CTCF位点的小CENP-E片段的过度表达导致有丝分裂期间一些染色体的排列延迟，这表明CTCF对CENP_E的补充在生理上很重要。我们的结论是，CTCF有助于在有丝分裂期间将CENP-E募集到着丝粒，并且可能通过CTCF/CENP-E复合物稳定的结构来实现。

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数字

图1
图1。着丝粒蛋白CENP-E与绝缘体蛋白CTCF相互作用
A.（Top）CTCF与CENP-E共免疫沉淀。从G2/M阻滞的K562细胞中提取的核提取物（NE）与兔IgG或兔抗CTCF抗体一起免疫沉淀（IP），如面板顶部（IP）所示。与CTCF共沉淀的CENP-E用CENP-E-抗体检测，如面板右侧所示。（中部和底部）CTCF在类似条件下不与CENP-A、CENP-B或CENP-C相互作用。B.CENP-E与CTCF共同免疫沉淀。与图1A类似的实验。用CTCF抗体检测与CENP-E共沉淀的CTCF。C.CTCF的N末端与CENP-E相互作用。顶部面板：MBP-CTCF下拉分析。将仅固定化MBP或重组MBP-CTCF N末端（CTCF-Nterm）、锌指（CTCF-ZF）和C末端（MBP-CTCFR-C）蛋白与K562细胞的NES孵育，通过Western blot分析用抗CENP-E抗体检测下拉CENP-E。底部面板：考马斯染色显示用于MBP下拉分析的蛋白质表达和纯化。通过将IP带的密度除以考马斯染色带的密度，并根据CTCF N项的相应比率进行归一化，计算相对带密度比。D.与CTCF交互的CENP-E域。用MBP结合珠纯化各种细菌表达的MBP-CENP-E融合肽，并与K562 NEs（顶面板）或CTCF培养在体外使用TNT库仑小麦胚芽提取物系统（IVT-CTCF，第二幅）表达）。用CTCF抗体检测相互作用。每条肽的初始和最终残基数显示在通道上方。每种情况下的最低面板显示纯化的CENP-E构建体的考马斯染色凝胶。E.与CTCF交互的CENP-E域的详细映射体外试验。用MBP珠纯化MBP融合的CENP-E肽，并用在体外表达CTCF，如图1.D所示。用CTCF抗体检测相互作用。下部面板显示纯化CENP-E构建物的考马斯染色凝胶。F.上面板：描述CENP-E碎片的示意图，这些碎片被测试与CTCF的相互作用。CENP-E中每个域的位置取自Chan等人（Chan等人，1998）和Liao等人（Liao等，1994）的描述。CENP-E的C末端包含一个动粒结合域和一个微管结合域。下部面板：图1E.++的交互结果摘要表示强烈的相互作用；+−适度相互作用；−−弱相互作用或无相互作用。与CTCF相互作用的最小片段不包含任何动粒结合域。
图2
图2。CENP-E与着丝粒周围/着丝粒区域的结合依赖于CTCF。（另请参见图S1）
A.用于小区同步的实验协议的示意图。RNAi敲除与胸苷和诺卡唑阻滞相结合，使HeLa细胞同步于G2/M期。通过western blotting分析监测击倒效率。B.HeLa细胞被抗CTCF或抗CENP-E siRNA耗尽，阻滞在G2/M期，并用甲醛处理以进行随后的ChIP实验（n=3的平均±SD）。上面板：耗尽细胞中CTCF或CENP-E的相对mRNA表达水平归一化为肌动蛋白mRNA的相对表达水平。下面板：使用核提取物通过SDS-PAGE和免疫印迹分析siRNA敲除效率。通过将CTCF或CENP-E带的密度除以肌动蛋白带的密度，并根据对照siRNA.C和D.CTCF和CENP-E-ChIP分析结果的比率进行归一化，计算相对带密度比。使用抗CTCF或抗CENP-E抗体免疫沉淀G2/M阻滞HeLa细胞的交联DNA-蛋白复合物，然后使用从着丝粒周围/着丝粒区域设计的引物进行ChIP-qPCR扩增（表S2）。IGF2/H19 ICR中的CTCF结合位点（chr11:2024182-2024346，GRCh37/hg19；引物ID 26，Wendt等人，2008）用作对照，不结合CENP-E。数值表示为相对于输入的折叠富集（平均值±s.E.m，n个= 3). 注意，CTCF结合的阳性对照位点，在H19印迹对照区（Bell和Felsenfeld，2000；Wendt等人，2008），仅组成性地占据在两个等位基因中的一个上。尽管浓缩量不大，但它是可重复的，并且在CTCF被击倒后会丢失。相反，在细胞周期的任何阶段，在H19 ICR的被占领CTCF位点都没有CENP-E的招募，这是CENP/E结合的阴性对照。在（C）中，控制和CENP-E击倒的值与CTCF击倒值有显著差异。使用Student t检验计算本图和其他图中的p值；（*）=p<0.05；（**）=p<0.01。在（D）中，CENP-E在除H19对照外的所有站点中都显著富集。这里，p值指的是CENP/E或CTCF敲除值与对照的比较。
图3
图3。CTCF和CENP-E与着丝粒周围/着丝粒区域的结合依赖于细胞周期。（另请参见图S1、S2和S6。）
HeLa细胞在G1/S、G2/M或有丝分裂中同步化，并在随后的ChIP实验中用甲醛处理（平均值±S.e.M，n个= 3). 用CTCF（A）和CENP-E（B）抗体免疫沉淀交联蛋白-DNA复合物。注意，在图3A中，Igf2/H19印迹控制区（H19 ICR）的CTCF结合与细胞周期无关。ChIP-qPCR引物与图2相同。C和D。对于所有染色体，条形代表n=3的平均值±SD。为了评估CTCF和CENP-E在G2/M和M期的结合是否存在统计学差异，使用Student t检验计算p值（*）=p<0.05；（**）=p<0.01。CTCF和CENP-E只有四个位点存在显著差异，这表明G2/M和有丝分裂阻滞之间的差异在大多数情况下并不显著。相反，在G2/M和G1期之间的大多数位点，CENP-E和CTCF结合都发生了显著变化。
图4
图4。CTCF与人类染色体的着丝粒/着丝粒区域结合。（另见图S3和S4）
A.本研究中公布的M2共识序列与用于凝胶位移实验的探针序列之间的比较。上面板：与MEME软件对齐的探针中的Motif DNA序列(网址：http://meme.nbcr.net); 中间面板：用MEME软件计算的motif一致序列；底部面板：采用施密特等人（Schmidt等人，2012）的M2共识序列。B.CTCF ZF 1–11与代表性着丝粒/着丝粒位点结合的分析。MBP融合CTCF ZF 1–11蛋白在细菌中表达，并用MBP结合珠纯化。然后将纯化的CTCF ZF 1–11蛋白与20 fmol生物素标记的寡核苷酸（从第15号染色体设计）在无标记的特异性寡核苷酸FII 45 bp（Renda等人，2007）的100倍过剩或存在的情况下孵育（车道2），以及100倍过剩的未标记的非特异性寡核苷酸（车道4）。C.分析与M1基序探针结合的各种CTCF锌指。每个纯化的MBP-CTCF片段（包含不同的锌指）与15号染色体M1基序特异的DNA探针孵育，并进行凝胶迁移分析。含有M1（Schmidt等人，2012）的探针不同于此处研究的其他DNA探针，并且与CTCF ZF 4-8 D强烈相互作用。分析各种CTCF锌指与典型M2基序探针的结合。每个纯化的MBP-CTCF片段（与图4.C中的相同）与针对第10染色体的DNA探针孵育，并进行凝胶迁移率变化分析（Schmidt等人，2012）。
图5
图5。CTCF锌指C末端部分与Chr8着丝粒/着丝粒位点的结合亲和力分析
A.CTCF ZF 7–11蛋白与8号染色体M2基序特异探针的结合亲和力分析。对于每一个结合反应，在20µl的体积中，使用100ng聚d（I-C）作为非特异性竞争物。此外，蛋白质的5 pmol分别与双探针的0.01、0.125、0.02、0.225、0.03和0.0325 pmol（从通道1到通道6）孵育。B.凝胶位移结合数据的Scatchard分析（n=3）。绘制了结合DNA与游离DNA的比率与反应混合物中结合DNA的摩尔浓度的关系。C.M2基序的突变破坏了CTCF ZF 7-11蛋白的结合。上部面板：野生型序列和突变序列的比较。下面板：使用10或20 fmol野生型或突变型探针进行凝胶迁移率变化分析。M2基序中的一个3-核苷酸突变（从GAG到TTC）显著降低了CTCF ZF 7-11蛋白与探针的结合。
图6
图6
标记的CENP-E（aa2528–2701）的过度表达导致HeLa细胞中一些染色体的延迟排列。（另请参见图S5。）用抗标记抗体或抗γ-微管蛋白抗体对转染有标记CENPE片段的HeLa细胞进行免疫染色。用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）观察DNA。单抗染色图像显示在左侧（第1、2和3列）；合并的图像显示在右侧（第5列和第6列）。黄色箭头表示染色体错位。A.携带CENPE aa2528–2701并显示正常染色体迁移的代表性细胞。B和C。具有相同结构的代表性细胞，表现出染色体迁移迟缓。D.免疫染色结果总结。显示延迟排列的细胞分布n个染色体作为的功能n个作为对照，用不同的CENP-E片段（aa2280–2331）转染细胞，该片段不与CTCF相互作用。
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