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.2015年8月；33(8):845-852.
doi:10.1038/nbt.3275。 Epub 2015年7月13日。

用于疾病建模和药物验证的人诱导多能干细胞衍生的胆管细胞

桑帕齐奥提斯 1 2, 米盖尔·卡多索·德布里托 # 1, 佩德罗·马德里加尔 # 1 2, 亚历山德罗·贝特罗 1, Kourosh Saeb Parsy公司 三, 菲利帕·A·C·索尔斯 1, 伊丽莎白·施伦普夫 4 5 6, Espen甜瓜 4 5, 汤姆·H·卡尔森 4 5 6, J安德鲁·布拉德利 三, 威廉·泰·盖尔森（William Th Gelson） 7, 苏珊·戴维斯 8, 阿拉斯泰尔·贝克 9, 阿瑟·卡斯尔 10, 格雷姆·亚历山大 11, 尼古拉斯·R·F·汉南 # 1, 卢多维克·瓦利埃 # 1 2
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用于疾病建模和药物验证的人诱导多能干细胞衍生的胆管细胞

桑帕齐奥提斯等。 Nat生物技术. 2015年8月.

摘要

由于缺乏原代人胆管细胞，胆道疾病的研究受到了限制。在这里，我们提出了一种有效的无血清方案，用于将人类诱导的多能干细胞定向分化为胆管细胞样细胞（CLC）。CLC显示胆管细胞的功能特征，包括胆汁酸转移、碱性磷酸酶活性、γ-谷氨酰转肽酶活性以及对分泌素、生长抑素和血管内皮生长因子的生理反应。我们使用CLC在体外模拟Alagille综合征、多囊性肝病和囊性纤维化（CF）相关胆道病的关键特征。此外，我们使用健康人和多囊肝病患者产生的CLC来复制药物维拉帕米和奥曲肽的作用，并且我们表明实验CF药物VX809在体外拯救了CF胆道病的疾病表型。我们的分化方案将有助于研究控制胆道发育的生物机制，以及疾病建模和药物筛选。

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数字

图1
图1
从人诱导多能干细胞（hiPSCs）生成胆管细胞祖细胞（CP）。（a）用于将hiPSCs分化为类胆管细胞（CLC）的方案概述。DE：确定性内胚层，FP：前肠祖细胞，HB：成肝细胞，HC：肝细胞，BMP，骨形态发生蛋白；Ly294002是磷脂酰肌醇-3-OH激酶抑制剂；CDM，化学定义介质；RPMI，罗斯韦尔公园纪念研究所媒体；SB，SB-431542；肝细胞生长因子；RA，维甲酸；表皮生长因子；FGF，成纤维细胞生长因子。（b）免疫荧光（IF）分析显示，在第12天的成肝细胞中，关键成肝细胞标记物的表达如图所示。比例尺对应100μm。（c）IF分析显示未成熟胆管细胞祖细胞（第16天）早期胆道标记物的表达：比例尺，100μm。（d）胆管分化关键阶段hiPSC衍生细胞和原代胆管细胞（PC）的基因表达谱。n=4个生物复制用于每个分化阶段。n=3个PC独立样本，中心线，中值；方框，四分位范围（IQR）；胡须，范围（最小到最大）。不计算保时捷中心的IQR，因为n=3。星号代表HBs、CP和CLC之间差异的统计显著性；#表示缺乏统计学意义（P>0.05）（多重比较的单向方差分析和Tukey校正）。数值与看家基因卟啉原脱氨酶（PBGD，也称为HMBS）有关。
图2
图2
从胆管细胞祖细胞（CP）生成胆管细胞样细胞（CLCs）。（a、b）CLC类器官（第26天）的免疫荧光（IF）（左）和光学显微镜（右）图像显示囊性病变的形成（a）和分支（箭头）管状结构（b）。比例尺对应100μm。（c）乙酰化α-管蛋白的透射电镜图像（右）和IF分析（左）显示纤毛的存在（箭头）。IF图像是使用共焦显微镜从一个巨大的囊性器官的底部获得的。比例尺：分别为500 nm和100μm。五十： 卢门。（d）IF分析显示，在第25天的CLC中，早期和成熟胆道标记物的表达如所示。比例尺：100μm。（e）欧几里得层次聚类分析侧重于定义CLC和HBs转录特征的基因（4963个基因在CLC与hiPSC或HBs与hiPSCs中差异表达）。对于每个探针，标准分数（z-scores）表示用所有样本中平均水平的标准偏差数测量的差异表达。与HBs或hiPSCs相比，CLCs与用作主要对照的胆总管胆管细胞（CBD）聚类更近，并且呈现更高的相关系数（Pearson，CLCs与PCs的比值r=0.747，CLCs与HBs的比值r=0.576，CLCs与hiPSCs的比值r=0.474）。显示了具有代表性的基因。这些数据对应于生物三倍体。
图3
图3
CLC类有机物的功能表征（a）展示在CLC类有机物管腔中检测到MDR1荧光底物罗丹明123的代表性图像，确认MDR1功能。比例尺，50μm。（b）沿红线所示区域的荧光强度测量。（c）在维拉帕米存在（+VER）或不存在（−VER）的情况下，在背景上归一化的平均管腔内荧光强度，n=599次测量，P（P）=2.99×10−5（双尾t检验）。（d）与负载异硫氰酸荧光素（FITC）的对照组相比，具有代表性的图像显示荧光胆汁酸-胆基-赖氨酰-荧光素酶（CLF）从CLC类有机物管腔主动输出。（e）沿红线所示区域的荧光强度。（f）根据背景归一化的平均腔内荧光强度，n=1163次测量，P（P）<1×10−18（双尾t检验）。面板a-f中显示的数据代表了3个不同的实验。（g）装载有钙指示剂Fluo-4的CLC类有机物的荧光强度测量（顶部）和代表性荧光显微镜图像（底部）表明，在ATP和乙酰胆碱刺激后，细胞内钙水平增加。用ATP刺激的平板原代胆管细胞作为阳性对照。灰色区域表示1 SD，n=3。（h，i）单元格起始数的折叠变化（h）增殖标记Ki-67的IF分析（i）在有无VEGF的情况下持续5天，证明VEGF促进CLC增殖。主要。胆汁：电镀原代胆管细胞，n=10，p=4.77×10−17（CLC），p=4.63×10−17（初级胆汁）（双尾t检验）。（j）CLC类有机物具有GGT活性。MEF：小鼠胚胎喂养器，n=3，p<0.0001，用于所有比较（单因素方差分析，多重比较采用Dunnett校正）。（k）ALP染色显示CLC类器官中的ALP活性。顶部：污渍井照片（比例尺：1cm）。底部：Brightfield显微镜图像，n=3。比例尺：100μm。多条测线的数据代表（图6a-6b，补充图5）。所有误差条表示面板c、f、h和j中的s.d.星号（****）表示所示差异的统计显著性（P<0.0001）。
图4
图4
激活素和Notch信号对CLC类器官的形成至关重要。（a）在含有或不含有SB-431542的基质凝胶中培养CP后，CLC类有机物的数量，表明抑制激活素信号传导继发于类有机物形成。误差条代表SD，n=4。（b）现场照片显示SB-431542缺乏有机物形成。比例尺：100μm。（c）表达的QPCR分析JAG1号机组,槽口2和Notch下游目标HES1型在CLC类有机物中，与在含有L-685458的基质凝胶中培养的CP相比，表明该标记的表达降低，以响应L-685458n=4。数值与看家基因PBGD有关）。中线、中线；方框，四分位范围（IQR）；胡须，范围（最小到最大）****P（P）<0.0001（双尾t检验）。（d）CLC类有机物中NICD与基质凝胶中培养的CP在L-685458存在下的IF分析表明，CLC类器官中NICD的通路激活和核定位与L-685458-通路抑制反应。比例尺：100μm，EL：管腔外空间。（e）在含有或不含L-685458的基质凝胶中培养CP后，CLC类有机物的数量表明，在抑制Notch信号后，类有机物形成显著减少。误差条代表SD，n=4。（f）现场照片显示，L-685458降低了有机物形成。每个面板中显示的数据代表了3个不同的实验。
图5
图5
CLC类有机物对分泌素和生长抑素刺激作出反应，并重现生长抑素类似物（奥曲肽）在多囊性肝病（PLD）中的作用体外试验。 （a）IF分析显示CLC中分泌素受体（SCR）的表达。比例尺：100μm。（b）IF分析显示生长抑素受体2（SSTR2）在CLC中的表达。比例尺：100μm。（c）现场图片展示了使用分泌物、生长抑素、奥曲肽、分泌物和奥曲肽联合治疗前后的CLC类有机物。每个图像中都显示了直径测量值。这些图像被裁剪为包括一个囊肿，但代表了所有测量的囊肿。（d）分泌素（SC）、生长抑素（SST）、奥曲肽（OCT）以及分泌素和奥曲肽的结合对类器官直径的影响。误差条代表SEM，n=8*P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）<0.001, ****P（P）<0.0001（多重比较的单因素方差分析和Dunnett校正。（e）分泌素治疗增加，而生长抑素和奥曲肽治疗降低CLC类器官中cAMP水平。误差条代表SEM，n=3，星号代表统计显著差异（单因素方差分析，多重比较采用Dunnett校正）。（f）QPCR显示多囊性肝病CLC中胆道标志物的表达。星号表示HBs、CP和CLC之间差异的统计显著性（多重比较的单向方差分析和Tuckey校正）。（克，小时）实时图像（g）和直径测量（h）在PLD-CLC类有机物中，奥曲肽或分泌素和奥曲肽的联合治疗前后，***：P（P）<0.0001（多重比较的单因素方差分析和Dunnett校正）。所示数据代表了3个不同的实验。
图6
图6
使用来自囊性纤维化患者的hiPSCs体外模拟囊性纤维化（CF）肝病。（a）对CF-hiPSCs（CF-CLC）产生的CLC类有机物进行QPCR分析，证明胆道标记物的表达。星号表示HBs、CP和CLC之间差异的统计显著性（单向方差分析，多重比较采用Tuckey校正）。（b）CFCLC类有机物表现出GGT活性。****：P（P）<0.0001（多重比较的Dunnett校正的单因素方差分析）。（c）IF分析显示CF-CLC中CFTR蛋白表达非常低，而wt-CLCs表达CFTR。（d）MQAE荧光强度归一化为最低强度值。MQAE荧光在氯化物存在下熄灭，但不受硝酸盐影响。细胞内或铝内氯化物水平随细胞外氯化物水平的变化取决于CFTR功能的存在。MQAE荧光增强是对硝酸盐挑战消耗细胞外氯化物的响应，而降低是对用VX809处理的wt-和CFCLC中氯化物的反应，但未能对用VX809+CFTR抑制剂-172处理的CFCLC和CF-CLC中的挑战作出响应。（e）实况图像显示，经VX809处理的wt-CLCs和CF-CLCs中的MQAE荧光随着硝酸盐激发而增加，随后随着氯化物激发而减少，但经VX80 9和CFTR抑制剂-172处理的CF-CLC和CF-CLC中的MQAE荧光保持不变。（f）现场图片展示了用VX809处理前后的CLC类有机物。每个图像中都显示了直径测量值。（g）VX809处理对平均类器官直径的影响。误差条代表SD，n=8，P（P）=0.001，（双尾t检验）。图像裁剪后包括1个囊肿，但具有代表性。所有显示的数据都代表了3个不同的实验。
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中的注释

  • 胆道：解决胆管细胞分化难题。
    Patman G。 帕特曼·G。 Nat Rev胃肠肝素。2015年9月；12(9):490. doi:10.1038/nrgool.2015.129。Epub 2015年7月28日。 Nat Rev胃肠肝素。2015 PMID：26215387 没有可用的摘要。

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